乙型肝炎病毒X基因表达产物对HLA-DR表达的影响

一、乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应（论文文献综述）

王晓雨^[1]（2021）在《肾组织中与狼疮性肾炎相关的失调基因生物信息学分析鉴定》文中研究说明目的:狼疮性肾炎（Lupus nephritis,LN）是一种由免疫介导的复杂的器官炎症,其发病机制仍不明确。本文利用GEO（Gene Expression Omnibus）数据库对LN患者肾小球组织的全基因转录数据进行生物信息学分析,挖掘与LN相关的基因、信号途径及转录因子,为今后对LN的研究奠定分子学基础。方法:1、在GEO数据库中联合GSE99339、GSE32591数据集进行LN相关差异基因表达分析和交集分析。2、使用Metascape工具对LN特异表达基因进行GO注释及和KEGG富集分析。3、使用STRING数据库识别LN特异基因的蛋白质相互作用并使用Cytoscape MCODE插件进行关键基因模块的筛选。4、通过KEGG,Reactome,HALLMARK信号途径数据库对LN特异基因进行富集分析,筛选出关键信号途径。5、使用TRUUST数据库寻找调控关键信号途径的转录因子。结果:1、LN组与正常对照组和其他肾病对照组相比,存在不同数量的差异表达基因,交集得到32个差异表达基因。32个基因在LN组中显着上调,在对照组中显着下调,作为LN特异性表达基因。2、LN特异表达基因主要富集在干扰素相关途径和丙型肝炎,甲型流感,麻疹,EB病毒感染等多种病毒感染过程中。3、Cytoscape MCODE插件在LN特异表达基因的蛋白质互相作用网络中,筛选出1个关键基因模块4、关键基因模块的基因显着富集在干扰素α,β及γ途径。5、TRUUST数据库显示STAT1,IRF1为3条信号途径的关键转录因子。结论:1、和其他对照组相比,LN组患者的肾组织中存在32个明显上调的差异表达基因。2、LN特异表达基因主要富集在多种病毒感染过程中,病毒感染和LN之间可能存在特定的联系。3、LN特异表达基因富集到的关键信号途径为干扰素α,β及γ途径。4、STAT1,IRF1为干扰素信号途径的关键转录因子,针对STAT1,IRF1的调控或可成为LN治疗的新靶点。

马宁^[2]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中研究指明第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。

李彤亚^[3]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中研究说明由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。

谭文婷^[4]（2016）在《HBV相关慢加急性肝衰竭的全基因组关联研究及主要位点HLA-DR功能解析》文中研究指明HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF）是我国及亚太地区慢性肝病患者常见的危急重症,临床上表现为短期内出现高胆红素血症、凝血酶原时间延长（INR≥1.5）,起病迅速,病死率高,缺乏特异治疗手段。目前认为HBV-ACLF的发生主要与宿主遗传因素、病毒以及宿主免疫相互作用有关,但是其确切的发病机制尚不明确。近年来,西方基于酒精性肝硬化的ACLF的研究报道较多,认为酒精性肝硬化相关ACLF患者从急性发作、炎症损伤、免疫失调到系统性炎症反应综合征（systematic inflammatory response syndrome,SIRS）、代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS）、再生反应等多环节事件的幅度和次序,决定着患者是炎症消退-康复还是进展到肝外器官衰竭,系统性炎症反应是酒精性肝硬化患者发生ACLF的主要驱动因素。慢性HBV感染者是否发生肝炎发作,发作后是否进展为肝衰竭,由于HBV缺乏慢性感染的动物模型,且ACLF的病因和诱因存在很大的异质性,目前对HBV相关ACLF的肝脏免疫学应答及免疫病理过程仍然知之甚少。既往针对HBV病毒序列变异的研究认为C基因启动子区、前C区和C区变异与乙型肝炎的发作及暴发性肝衰竭相关。但是,同样的前C、C区变异既可以见于不同的病变表型（普通乙型肝炎、肝硬化、肝癌）,也可见于无症状携带者。事实上,病毒变异是否导致乙型肝炎重症化的发生和发展,受到宿主因素的制约。乙型肝炎的发生、发展和转归,是病毒（病毒载量、变异、进化）和宿主（遗传异质性、年龄、性别等）通过免疫应答相互作用导致的常见复杂疾病。常见复杂疾病（common complex diseases）通常由许多微效累加基因与环境因素共同作用而决定的。HBV-ACLF的发生、发展,涉及到免疫识别、炎症活化/放大、肝细胞坏死、SIRS、CARS、器官衰竭等多个环节,也属于常见复杂疾病的范畴,其遗传因素也涉及多个微效基因的作用。在复杂疾病遗传易感性研究中,关联研究-连锁不平衡分析方法最为常用,统计效能也远高于家系连锁分析。基于全基因组策略的遗传关联研究,是目前复杂疾病遗传关联研究的主流,与候选基因策略相比其优点在于统计效能有着极大的提高,同时可以避免群体分层偏倚和基因选择的偶然性,可以从全基因组角度获得复杂疾病遗传特征的全局、系统的认识。开展HBV-ACLF表型的全基因组关联研究（genome-wide association study,GWAS）,解析其全基因组范围内的宿主遗传位点及遗传关联图谱,有助于认识HBV-ACLF的驱动机制及干预靶点。因此,本课题在建立HBV-ACLF病例大样本、多中心队列的基础上,对其临床特征及炎症因子谱进行了分析,开展了HBV-ACLF的全基因组关联研究,并对主要关联位点HLA-DR进行了精细解析和功能注释,以及阳性关联HLA等位对HBV变异的限制性分析。本研究结果首次从全基因组角度明确了HBV-ACLF的主要遗传位点,提示HLA-DR等位限制性CD4+T细胞途径对HBV-ACLF的驱动作用。本课题的主要研究结果如下:1.共纳入1300例HBV-ACLF患者和2087例HBV无症状携带者进入3-stage的全基因组关联研究,样本来自重庆、北京、泉州、遵义、南宁5个中心。所有患者均无抗病毒史、无既往肝炎发作或肝功能失代偿病史。对1300例HBV-ACLF患者进行临床特征分析,LC-ACLF占60%左右,NLC-ACLF占40%;HBe Ag阴性的HBV-ACLF占60%,HBe Ag阴性并且HBV DNA<104 IU/m L的HBV-ACLF占17.1%。与LC-ACLF相比,NLC-ACLF患者表现为更年轻（平均年龄39.5 vs.43.9岁,p=3.14×10-11）、更高的ALT水平（平均值1153 vs.809 IU/L,p=1.36×10-11）、腹水阳性率较低(58.7%vs.88.4%,p=9.25×10-35)、起病后更短时间内INR达到1.5及发生脑病（平均值分别19.8vs.24.8天,p=1.36×10-11;27.3 vs.38.1天,p=5.16×10-6）。2.对1013份患者血清样本进行35种细胞因子的多重定量检测,结果显示,国外酒精性肝硬化ACLF研究所关注的重要指标PCT（提示细菌感染）和CRP（提示肝外器官衰竭）,在我们HBV-ACLF患者中其浓度低于普通慢性乙型肝炎（CHB）患者。与慢性乙型肝炎轻中度及重度相比,HBV-ACLF患者显着升高的细胞因子有6种:Th1型细胞因子IL-1a、TNF-β,Th2型细胞因子IL-5、IL-10和IL-13,Th17型细胞因子IL-17。3.HBV-ACLF的GWAS初始阶段分析显示全基因组范围内1、6、12号染色体有显着的关联信号（p<1×10-5）,LC-ACLF和NLC-ACLF两种亚型的共同遗传关联位点位于6号染色体HLA-II区域。经过replication 1a和1b独立样本验证表明HLA-DR区域是主要关联位点,再经过replication 2a和2b验证,明确了rs3129859与HBV-ACLF显着相关（P combine=7.40×10-19,OR=1.83）。4.分层分析显示rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素,与慢性乙型肝炎活动状态和HBV再活化无关。风险等位rs3129859*C与HBV-ACLF临床进程相关,携带风险等位rs3129859*C的ACLF患者和S-CHB患者,在入院28天时INR达到1.5及发生腹水的风险更高（分别有p=3.95×10-4,p=3.03×10-4）。在NLC-ACLF亚组,携带风险等位rs3129859*C的患者,28天死亡率更高（p=0.03）。5.HLA-DRB1*1202等位是HBV-ACLF最显着的风险等位（p=3.94×10-6,OR=2.05）。HLA-DRB1*1202的全球分布与HBV-ACLF地理流行病学趋势一致,在中国（5.9-21.7%）和东南亚地区（6.8-35.3%）等位频率最高。6.HLA-DRβ第28位氨基酸是最显着的关联氨基酸（p=3.03×10-6,OR=1.75）。其次,关联的氨基酸还包括HLA-DRβ蛋白第26、30、32、37、38和85位氨基酸,以及HLA-DQα蛋白第40、47、50、51、53、56、69、76位氨基酸和HLA-DQβ蛋白第45位氨基酸（p<0.001）。蛋白结构三维重建显示这些关联氨基酸位于HLA分子抗原结合沟槽内。7.等位单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301和氨基酸单倍型DRβ-LEHHLLA-DQα-GCVLQdel TL-DQβ-E是风险单倍型,携带风险单倍型的HBV感染者,罹患ACLF的风险更高（additive model,分别p=1.16×10-4,OR=1.94;p=2.43×10-6,OR=2.10）。8.生存分析提示风险等位及风险单倍型与HBV-ACLF临床进程相关。在非肝硬化ACLF亚组,携带风险单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301的患者入院后28天（p=3.49×10-4）、90天（p=0.003）及180天（p=0.003）的死亡率更高,且肝性脑病发生率更高（p=0.019）,氨基酸单倍型也观察到一致的相关性。9.HBV-ACLF关联位点功能注释:e QTL分析显示关联位点rs3129859与HLA-II基因表达相关;GRAIL文献分析显示HLA-DR和HLA-DQ是最合理的关联基因。与其他HBV相关GWAS文献overlap分析,显示HBV-ACLF的遗传关联位点与慢性HBV感染的遗传关联位点有部分重叠。10.通过分析HLA-DRB1*1202风险等位对HBV变异的限制作用,鉴定出12个HBV变异,既表现出HBV-ACLF风险等位HLA-DRB1*1202特异性和肝炎活化特异性,同时也是病毒发生正选择的热点氨基酸位置。表位预测分析发现,这些变异可引发病毒表位漂移。结论:1.我们的数据对于认识HBV-ACLF的自然史有重要意义:相当比例的慢性HBV感染者可在无肝硬化基础的情况下发生ACLF;HBV自然史处于低复制期和e抗原阴性期的患者,发生ACLF的风险不容忽视;NLC-ACLF的疾病进展更为迅速,HBV-ACLF发病年龄（42岁）远低于欧洲酒精性肝硬化ACLF患者（56岁）。2.HBV-ACLF患者血清炎症因子谱分析表明HBV-ACLF患者确实存在剧烈的SIRS和CARS并存局面。HBV-ACLF患者CD4 Th细胞因子通路剧烈活化,有别于慢性乙型肝炎轻中度和重度,也不同于欧洲酒精性肝硬化ACLF患者。3.NLC-ACLF和LC-ACLF亚型具有共同的遗传易感位点,亚型位点、定量性状位点（肝酶、性激素等）与HBV-ACLF位点通路存在交互作用。4.HLA-DR是HBV-ACLF的主要遗传易感位点,风险等位rs3129859*C和HLA-DRB1*1202可作为HBV-ACLF临床预警预后的marker。风险等位有特异限制的病毒变异位点,与肝炎活化、病毒正选择和表位漂移有关。总之,本研究首次在HBV相关慢加急性肝衰竭患者中开展了全基因组关联研究,从全基因组范围内鉴定出HLA-DR是HBV-ACLF的主要关联位点,且关联的风险等位和单倍型与HBV-ACLF临床进程显着相关,提示了HLA-II类分子限制的CD4+T细胞途径在HBV-ACLF的免疫病理过程中的重要作用,同时也表明肝硬化和非肝硬化基础的HBV-ACLF为同质性疾病,支持一个疾病的假说（one disease hypothesis）。

韦柯利^[5]（2013）在《HLA-DRB1*09/12/15等位基因对广西HBV相关性肝病的影响研究》文中提出目的：探讨人类白细胞抗原基因复合体（HLA）-DRBl*09、12、15三个等位基因对广西地区乙肝病毒感染相关性肝病（简称“HBV肝病”）病情进展的影响,以及等位基因对慢性HBV肝病患者e抗原表达的影响,为寻找慢性乙肝病情转归的易感基因或拮抗基因提供线索。方法：随机选取在广西医科大学第一附属医院感染性疾病科及肿瘤医院肝胆外科就诊的HBV感染相关性肝病患者265例作为研究对象的病例组,包括慢性无症状乙型肝炎病毒携带者（asymptomatic chronic hepatitis B,简称“慢性HBV携带者”或ASC）64例、慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B,简称“慢乙肝”或CHB）80例、乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis,简称“肝硬化”或LC）65例、原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,简称“肝癌”或HCC）56例,另外以体检健康的正常人75例作为正常对照组（normal controls,简称“对照组”或NC）；根据2005年中华医学会《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准及本研究拟订的排除标准确定研究对象,共纳入340例研究对象,所有研究对象均为广西户籍。应用聚合酶链反应/序列特异性引物基因扩增（PCR-SSP）方法检测HLA-DRB1*09、12、15等位基因在研究对象中的表达,统计分析三个等位基因表达与HBV肝病的关联性。结果：（1）HLA-DRBl*09及*12两个等位基因在各肝病组及对照组中表达频率比较差异均无统计学意义（P值均>0.05）。而HLA-DRBl*15等位基因在各肝病组及对照组中表达频率组间分布差异有显着统计学意义（x2=15.448,P=0.004）；进一步分析HLA-DRBl*15等位基因在各肝病组间表达频率两两比较结果显示,乙肝肝硬化组表达频率为10.8%,显着低于其余各组,分别与正常对照组（34.7%,x2=11.038,P=0.0008）、慢乙肝携带组（39.1%,x2=13.840,P=0.0001）、原发性肝癌组（33.9%,x2=9.564,P=0.002）、慢乙肝组（33.8%,x2=10.551,P=0.001）比较,均有显着统计学差异（P值均<0.05）；其余各组之间两两比较均无统计学差异（P值均>0.05）。（2）HLA-DRBl*09/12/15等位基因对HBeAg表达的影响根据乙型肝炎病毒标记物检测结果,将265例慢性HBV感染者分为HBeAg阳性组和阴性组,各肝病组也分为HBeAg阳性组和阴性组,比较每个基因在HBeAg阳性组和阴性组之间表达频率的差异,并分别与正常对照组比较。统计结果显示HLA-DRBl*12等位基因在265例HBV肝病患者中,HBeAg阳性组的基因频率为34.5%,HBeAg阴性组的基因频率为18.7%,两组间基因频率比较具有显着统计学差异（x2=8.541,P=0.003）；进一步比较HBeAg阳性组与正常对照组（17.3%）的基因频率也有具有统计学差异（x2=6.616,P=0.010）。（3）HLA-DRBl*09/12/15基因在壮、汉族研究对象中的分布统计结果显示,在251例壮族组中,HLA-DRBl*09.12.15等位基因表达频率分别是19.1%、23.1%和29.1%；在83例汉族组中分别为19.3%、25.3%和34.9%；在病例组民族分析中,三个等位基因在汉族和壮族组间的表达频率均无统计学差别；在正常对照组民族分析中,三个等位基因在汉族和壮族组间的表达频率均无统计学差别。结论：（1）HLA-DRBl*15等位基因可能降低HBV感染者进展为乙肝肝硬化的风险,即该基因可能是广西慢性HBV感染者发生肝硬化的抵抗基因；（2）在广西慢性HBV感染者中,携带HLA-DRBl*12等位基因患者可能不利于自动清除e抗原；

张卿,李俊刚,刘玉元,赵博,张绪清^[6]（2012）在《HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响》文中研究指明目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein,EGFP）表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为（6.4±3.5）%,显着低于电穿孔法（41.46±5.8）%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为（5.1±3.9）%,显着低于电穿孔方法（37.5±4.1）%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。

赖钦涛^[7]（2012）在《CD4-CD8-双阴性T细胞在慢性乙型肝炎及抗病毒治疗中的免疫学研究》文中提出研究背景世界上超过3.5亿人为慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染,在中国慢性感染人数占总人口的7.18%,约9300万人,这导致肝硬化、肝功能失代偿、肝细胞癌（HCC）的患病风险大大增加,严重危害人们身心健康。HBV的传播以经血传播为主,如母婴传播和有创暴露。急性感染HBV的慢性化风险新生儿感染达90%,婴儿感染约25%-30%,成人感染低于5%。目前慢性HBV感染多由于母婴传播或婴幼儿期HBV感染,其自然史根据病毒与宿主之间的相互作用可分为：免疫耐受期（immune tolerance phase,IT）,免疫清除期（immune clearance phase）,非活动期（inactive carrier state phase,IC）和再活动期（Reactivation phase）。多数IT患者呈HBeAg阳性、高水平HBV DNA、正常稳定的ALT和肝组织学无明显病变；相当的IT患者会进入免疫清除期,表现为ALT逐渐升高,HBV DNA稍下降,HBeAg持续阳性,肝组织出现病理损伤,此为常见的HBeAg阳性慢性乙型肝炎（CHB）病人；其中的HBeAg清除率每年为8%-12%,自发实现]HBeAg血清学转换的患者中67%到80%HBV DNA检测不到或呈低水平,ALT正常稳定,肝组织病理未见进展,此为IC患者,处于一种对HBV的免疫控制状态；另外,多是病毒突变发生免疫逃逸所致,10%到20%的IC出现HBV再激活和肝组织的病变进展,即为活动期,多表现为HBeAg阴性乙型肝炎。临床上CHB患者抗病毒治疗的目的是抑制病毒复制,减轻肝脏病理损伤,相对满意的疗效是实现HBeAg血清学转换。无论是自发的还是药物诱导的HBeAg血清学转换,均意味着达到一种相对稳定的免疫控制状态,能减少肝脏并发症和提高生存率,IC患者即可认为是自发HBeAg血清学转换后的状态。但是无论自发的还是抗病毒治疗诱导的HBeAg血清学转换率仍低,很多即使经抗病治疗抑制HBV至相当低水平时仍未能出现HBeAg血清学转换,其中的机制仍不明。有研究显示其与某些免疫学因素相关,如IL-10和IL-12的血清水平及相应的基因多态性与早期自发的HBeAg血清学转换相关,IL-12与IL-21水平的变化和差异与治疗诱导的HBeAg血清学转换相关,但其中确切的免疫学机制还是不清楚。不能达到免疫控制状态更多被认为与对HBV免疫应答低下的相关,从急性自限性乙型肝炎中可以得到启示,对HBV实现免疫清除和控制与强劲的、广谱的HBV特异性T细胞相关,相反,在CHB中T细胞对HBV的免疫应答微弱、寡克隆和难以测及；有研究显示IC患者无论在外周血和肝脏中比CHB均有更多功能性HBV特异性的CD8+T细胞,在IC或IFN-a治疗诱导实现HBeAg血清学转换的患者当中其CD8+T细胞应答程度上和特异性与自限性乙型肝炎恢复期的患者中相近,提示CD8+T细胞免疫应答低下与未能实现对HBV的免疫控制密切相关。HBV特异性CD8+T细胞的功能低下与多种因素相关,如CHB中功能缺损的树突状细胞（dendritic cells,DC）、高水平的CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）、 PD-1高表达的耗竭性HBV特异性T细胞等,但这些仍未见与HBeAg血清学转换密切相关或能早期预测HBeAg血清学转换的报道,可能还不是其中的关键因素,或者还存在其他因素。免疫学当中越来越多研究显示免疫负调节特别是负调节性T细胞在维持对自身和外源抗原的免疫耐受或免疫低应答当中起重要作用,本研究中我们关注了另一具有免疫负调节作用的T细胞亚群,CD4-CD8-双阴性T细胞（CD4-CD8-double-negative T cell, DNT）, DNT细胞根据T细胞受体（TCR）的αβ链和γδ链分为αβDNT细胞和γδDNT细胞。αβDNT细胞在小鼠和人中均是分化成熟、具备自身表型特点的T细胞亚群,能特异性抑制CD8+T细胞的功能,近期在HBeAg-TCR双转基因小鼠的研究当中显示,HBeAg特异性的αβDNT细胞能显着抑制HBeAg特异性的和非特异性的效应性T细胞,人异体血干细胞移植治疗后αβDNT外周血频数高的患者移植物抗宿主病发病率低,提示αβDNT细胞参与了外周免疫耐受。γδDNT细胞属于γδT细胞,γδT细胞大部分不表达CD4或CD8,小鼠和人γδT的研究中均显示γδT细胞在保护性免疫中有重要作用,也有越来越多的研究显示小鼠γδT对免疫耐受是不可或缺,特别是口服耐受、眼器官耐受以及对肿瘤的低应答性均与其密切相关,人γδT细胞也陆续有报道发现具备重要的免疫调节作用。于是我们推测,αβDNT细胞和γδDNT在HBV慢性感染过程中有可能参与了对HBV的免疫应答低下。本研究首先选择处于HBV不同自然史分期的人群,包括IT、CHB、IC漫性HBV感染者及健康人对照（HC）,检测循环中DNT细胞亚群的频数,横向分析其与对HBV不同免疫状态的关系；接着在替比夫定（LDT）治疗52W周的临床队列中纵向分析DNT细胞亚群频数的变化以及与HBeAg血清学转换的关系；根据横向研究和纵向研究结果,体外实验探讨DNT细胞对CD8+T细胞功能的影响,并且通过检测DNT表达的活化分子、免疫共抑制分子的和潜在分泌的细胞因子来进一步探讨DNT在CHB中的免疫学特点。研究目的探讨αβ3DNT细胞和γδDNT细胞与慢性HBV感染和抗病毒治疗的关系以及在其中所起的作用。研究方法1.研究对象：横向研究中选取了3组慢性HBV感染患者,所有的患者来源于南方医院门诊病人,根据2009年AASLD的自然史分期标准进行分组,HBsAg阳性均大于6个月,年龄18-60岁,其中有IT组有22例,ALT至少两次正常（ALT≤0IU/L）,高水平HBV DNA （>1×107copies/mL）;IC组有25例患者,符合HBeAg-阴性,anti-HBe-阳性,ALT≤40IU/L和HBV DNA<1×104copies/mL; CHB组患者有68例,其中51例来自于临床试验中的基线标本,患者要求至少两次ALT>40IU/L, HBV DNA>1×105copies/mL和HBeAg-|阳性。健康对照组有32例,招募于南方医科大学教职员工和学生,均为HBeAg-阴性、anti-HBe-阴性和ALT≤40IU/L,排除肝脏病史。纵向研究对象为LDT单药治疗的病人,来自南方医院感染内科两个临床试验：一项多中心开放的替比夫定治疗iv期临床试验（"phase IV, multi-center, open-label clinical trial of telbivudine", n=21, LDT600mg/d, trial CLDT600ACN07T）和一项关于替比夫定优化治疗的临床试验"the Efficacy Optimization Research of Telbivudine Therapy trial", EFFORT, n=30, trial NCT00962533)。患者主要的入选标准同CHB,所有患者要求抗丙肝病毒、抗丁肝病毒、抗甲肝病毒IgM、抗戊肝病毒IgM和抗艾滋病病毒抗体都为阴性,在LDT治疗过程中分别留取了基线、12周、24周和52周血标本,用于检测DNT细胞亚群。2.外周血单个核淋巴细胞的分离（PBMC）和流式检测：PBMC采用Ficoll-Hypaque梯度离心法进行分离,并用含10%二甲亚砜的胎牛血清中梯度冻存至液氮,用时经复苏后用荧光素偶联抗体进行标记检测DNT细胞亚群：anti-CD3-APC （UCTH1）、anti-TCRγδ-FITC（11F2）、anti-CD4-PE、anti-CD8-PE和anti-TCRαβ-PE-Cy7（IP26）。3.肝脏侵浸润淋巴细胞（Liver-infliltrating lymphocytes, LIL）的分离：肝穿组织在满足常规肝活检组织病理分析诊断的情况下有多余时用于LIL的分离。用眼科剪柔和地将肝组织剪成1-2mm3细块,用10%FBS-RPMI1640（R10）洗涤两次,洗去残余的血块之后放入消化液(含500μg/mL胶原酶Ⅳ、20μg/mL DNaseⅠ、2%FBS和0.6%BSA中37℃消化30min,总消化液通过70-nm尼龙滤膜过滤去除残余的组织块,滤液500g/min离心7min,0.5%PBS洗涤一次后,与同期获取的PBMC进行流式标记检测DNT亚群。4.胞内细胞因子的染色（intracellular cytokine staining, ICS）:由Sigma-Aldrich公司合成的26段18肽（Core peptides pool）以重叠10个氨基酸残基覆盖HBV核心蛋白开放阅读框序列全长,标记为Core,以HIV gag蛋白上的一18肽作为阴性对照。按下操作进行ICS检测：以5×105个细胞/100gL的细胞浓度培养,加入刺激物（分为“空白刺激”、"anti-CD3（OKT,5μg/mL）和anti-CD28（1μg/mL） antibodies"、"peptides （3μg/mL）、anti-CD49d（1μg/mL）和anti-CD28（1μg/mL）"或者"50ng/mL Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）和1μmol/L calcium ionomycin"）1h后,再加入BrefeldinA（1μg/mL）继续培养5h。收集细胞用流式检测抗体进行表型标记（如CD3、CD4、CD8等）,依次细胞洗涤、固定和破膜后用检测细胞因子的荧光素抗体进行标记,上流式细胞仪检测和分析。5. γδDNT细胞对CD8+T细胞功能的影响：5.1γδDNT细胞对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：γδT细胞频数中不到1%的细胞表达CD4暂可忽略,纯化γδDNT时主要是去除CD8+γδT细胞,先用anti-CD8磁珠去除PBMC中的CD8+细胞获取CD8（-）PBMC,再用γδT细胞磁珠分选试剂盒阳性分选出γδT细胞,记为γδDNT细胞,检测其纯度。γδDNT细胞与TCRγδ（-）PBMC以1：2混合,与TCRγδ（-）PBMC管分别加入Core（终浓度3μg/mL）刺激培养,同时TCRγδ（-）PBMC管设置加或不加HIV短肽（Gag）作为阴性对照或空白对照,每管细胞数6×105,采用ICS（细胞表型采用anti-TCRγδ-FITC、anti-TCRαβ-PE-Cy7和anti-CD8-APC-Cy7标记）检测αβCD8+T细胞中IFN-γ（PerCP-Cy5）的产生。5.2不同γδT细胞频数对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：选择γδDNT/γδT>80%的患者,分离γδT细胞与TCRγδ（-）PBMC,γδT细胞与TCRγδ（-）PBMC以0：8、1：2、1：4和1：2混合,在Core刺激下,采用ICS（细胞表型采用anti-TCγδ8-FITC、anti-TCRαβ-PE-Cy7和anti-CD8-APC-Cy7标记）检测各比例组在αβCD8+T细胞中IFN-γ（PerCP-Cy5）和TNF-α（PE）的产生。5.3不同γδT细胞频数对CD8+细胞非特性活化产生IFN-γ的影响：γδT细胞（γδDNT/γδT>80%）与TCRγδ（-）PBMC以0：16、1：16、1：4、1：2和1：1混合,分别在5μg/mL anti-CD3（OKT3）和1μg/mL anti-CD28抗体刺激下,采用ICS方法（细胞表型采用anti-TCRgd-FITC、anti-CD8-APC-Cy7和anti-CD4-APC抗体标记）,胞内采用IFN-γ-PerCP-Cy5标记检测IFN-γ在CD8+细胞中的产生。5.4不同γδT细胞频数对CD8+细胞非特性增殖的影响：γδT细胞（γδNT/γδT>80%）与CFSE标记的TCRγδ（-）PBMC以0:16、1:16、1:4、1:2和1：1混合,每管细胞数5×105,5μg/mL anti-CD3（OKT3）和1μg/mL anti-CD28抗体刺激下,培养3天（严格不超过3天）,用anti-CD8-PE和anti-CD4-APC抗体标记,检测CD8+细胞的增殖百分比。6.CHB中DNT细胞亚群的免疫学特点：来源于横向研究的病人标本同时应用于对DNT的免疫学特点分析,采用以下荧光抗体组合进行流式检测分析：6.1.活化分子的表达：CD69和HLA-DR:anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、anti-CD8-APC anti-TCRγδ-FITC、anti-CD69-PE-Cy7和anti-HLA-DR-PE6.2.共抑制分子的表达：6.2.1.PD-1和PD-L1:anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、 anti-CD8-APC、anti-TCRy8-FITC、anti-PD-1-PE-Cy7和anti-PD-L1-PE6.2.2.CD160和BTLA4:1anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-FITC、anti-CD8-FITC、anti-TCRap-PE-Cy7、anti-BTLA-PE和anti-CD160-Alex fluor6476.2.3. NKG2A:anti-CD3-APC-Cy7、anti-TCRγδ-FITC、anti-CD4-PE-Cy7、 anti-CD8-PerCP、anti-CD56-APC和anti-NKG2A-PE6.3.潜在的细胞因子分泌功能：6.3.1从CHB患者中留取的新鲜全血直接加入brefeldinA（1μg/mL）培养6h,采用ICS方法检测DNT细胞亚群中TGF-β和IFN-γ细胞因子的产生：anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、anti-CD8-APC、anti-TCRγδ-FITC、anti-TGF-β-PerCp Cy5.5和anti-IFN-γ-PE。6.3.2从CHB患者中的新鲜分离的PBMC采用PMA刺激方法进行检测TGF-β、IFN-γ、IL-10、IL-17和IL21等细胞因子的产生。7.HBV抗原对DNT细胞亚群频数的影响：从LDT治疗超过52周的患者中包括15例非应答者和11例应答者中分离的新鲜PBMC,经CFSE标记后分为3组不同刺激物培养：空白孔、rHBcAg（10μg/mL）和rHBeAg（10μg/mL）,7d后收集细胞进行荧光抗体标记：anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-APC、 anti-CD8-APC和anti-TCRαβ-PE-Cy7,流式分析增殖细胞中DNT细胞亚群的频数。8.统计学分析：HBV DNA转换为log值进行统计学分析,数据以中位数（范围）表示,根据不同数据采取合适的统计学分析方法,,包括Chi-Square Tests、 Kruskal-Wallis H test、Mann-Whitney U test、Friedman Test、Wilcoxon matched pairs test、Spearman rank order correlation coefficient、logistic regression和receiver-operating characteristic curves（ROC）,所用统计学软件包括SPSS13.0和GraphPad Prism5,统计学水准：P值（双侧）<0.05被认为有统计学意义。结果1.在HBeAg阳性和阴性HBV慢性感染者中横向比较DNT细胞亚群频数。外周血αβDNT细胞、γδDNT细胞、和总γδT细胞在CD3+细胞中的频数依次在IT、CHB、IC和HC组中进行统计学比较,在总体比较（Kruskal-Wallis H test）有统计学差别的前提下比较两组之间的差异（Mann-Whitney U test）, αβDNT细胞（overall P=0.006）在CHB组（1.02%）显着高于HC组（0.72%,P=0.007）和IC组（0.70%,P=0.006）,在IT组（0.97%）与HC（P=0.073）或与IC组（P=0.052）之间尚无统计学差别；而γδDNT细胞在CHB组（8.3%）显着高于HC组（5.4%,P=0.002）和IC组（5.5%,P=0.004）,并且在IT组（6.8%）也高于HC组（P=0.027）和IC组（P=0.030）；γδT细胞除了在IT组中与HC组没有显着差异（P=0.103）,在各组间的统计学比较结果与γδDNT细胞类似。另外我们还分析了CD4+/CD8+γδT细胞的情况,CD4+/CD8+γδT%=γδT%-γδDNT%,在各组总体间没有统计学差异（P=0.305）,各细胞亚群在CHB组与IT组之间或IC组与HC组之间均没有显着差异。Spearman相关分析显示4种细胞亚群的频数与HBV-DNA,ALT, AST或age之间均没有显着相关。2.抗病毒治疗过程中γδDNT细胞与HBeAg血清学转换有关LDT抗病毒治疗过程中,总体比较αβDNT细胞并没有显着变化（overall by Friedman test, P=0.125）,但其他时间点与基线比较时,αβDNT细胞在24W（Wilcoxon matched pairs test, P=0.009）或52W（P=0.010）有所下降,γδDNT细胞,CD4+/CD8+γδT细胞和总的γδT细胞频数在各时间点之间均没有统计学差异（P>0.05）。52周后分为HBeAg血清学转换（应答组）和非血清学转换（非应答组）之间的差异,各时间点αβDNT细胞和CD4+/CD8+γδT细胞频数在应答组和非应答组之间未见显着性差异,而γδDNT细胞频数在应答组中基线（5.1%,P=0.019）和12W的（5.8%,P=0.041）显着低于非应答组（基线为10.3%,12W为10.4%）,而在24W（P=0.071）或52W（P=0.070）的γδDNT细胞频数在应答组与非应答组之间的差别没达到统计学水准,可能是由于应答组中γδDNT细胞有升高的趋势；总的γδT细胞在各组间的统计学比较结果与γδDNT细胞类似,CD4+/CD8+γδT在应答组和非应答组之间没有统计学差异,提示γδT细胞频数的差异主要由γδDNT细胞所决定。另外,EFFORT临床试验中,基线HBeAg半定量水平的中位数在应答者（n=12）中低于非应答者（n=18）,但两组之间没有统计学差异（P=0.075）,HBeAg水平与γδDNT细胞之间不相关（r=-0.02,P=0.930）单变量logistic回归分析显示HBeAg血清学转换与γδDNT细胞（P=0.040）和HBV-DNA（P=0.005）均有相关,但多变量分析中,只有HBV DNA（P=0.008）有显着效应,而y8DNT细胞（P=0.075）只有独立效应趋势,两者间没有交互作用（P=0.77）。在本研究队列中,应用受试者工作特征曲线（ROC曲线）方法分析显示基线γδDNT细胞频数能预测LDT治疗后52周的应答者（AUC=0.696,P=0.019）, γδDNT细胞占CD3+T细胞频数用于预测应答者最优的cut-off值为7.65%,相应的灵敏度是70.0%,特异度为71.0%,最高的阳性预测值是87.8%,对应的γδDNT细胞频数为4.8%,最高的阴性预测值是71.4%,对应的γδDNT细胞频数为15.2%,γδDNT细胞在12w的频数或总的γδT细胞的统计学分析结果与基线的γδDNT细胞频数类似,而HBVDNA水平的ROC曲线分析显示,HBVDNA同样可预测应答者（AUC=0.76,P=0.002）。3.肝内的DNT细胞：从26例LDT治疗超过72周的CHB患者（9例为应答者,17例为非应答者）中分离出LIL,与同期获取的PBMC一起进行抗体标记,流式分析DNT的相关细胞亚群。经Spearman相关分析,αβDNT细胞（r=0.505,P>0.001）和γδDNT细胞（r=0.231,P=0.020）在肝内的频数均与外周血中的频数存在正相关关系,比较外周血之间采用Wilcoxon matched pairs test,比较应答组和非应答组采用Mann-Whitney U test。所有患者中αβDNT细胞频数在肝内显着高于外周血（P<0.001）,在应答组（PBL:0.90%,LIL:1.4%, P=0.028）或非应答组（PBL:1.00%,IL:2.10%,P=0.001）也是肝内高于外周血,外周血和肝内比较应答组和非应答组没统计学差异（PBL:P=0.957; LIL:P=0.293）;γδDNT细胞（图D）在所有患者中的肝组织和外周血中频数则没有统计学差异（P=0.107）,非应答组中肝内与外周血之间也没有统计学差异（P=0.407）,但在应答组中,肝内高于外周血（P=0.021）,外周血中非应答组（6.5%）显着高于应答组（4.4%,P=0.019）,在肝组织中尽管在应答组与非应答组之间没有统计学差异（P=0.067）,但其中位数在非应答组（8.4%）中高于应答组（5.2%）,基本与外周血一致。4.CHB患者中γδDNT细胞对CD8+T细胞功能的影响。4.1γδDNT细胞对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：分离γδDNT细胞时,鉴于CD4+γδT细胞占γδT细胞不到1%,暂忽略不计,CD8+γδT细胞占γδT细胞27%（10%-52%）,采用磁珠分选的办法去除CD8+γδT细胞,但由于CD8+γδT细胞上的CD8分子呈弱表达,难于完全纯化,共来自于8例CHB患者,经纯化后γδDNT细胞在γδT细胞中的纯度为88.9%（86.1%-96.1%）,γδT（-）PBMC中αβCD8+T细胞产生的IFNγ频数在Core组显着高于空白刺激组（blank组,P=0.012）和阴性对照组（Gag组,P=0.017）,即能检测到HBV特异性的CD8+T细胞应答,γδDNT细胞以1：2的比例掺回γδT（-）PBMC后,αβCD8+T细胞产生的IFNγ频数显着下降（P=0.012）4.2不同γδT细胞频数对HBV特异性CD8+T细胞应答的影响：选择γδDNT/γδT>80%的患者,共4例,采用磁珠分选方法分离γδT细胞,以γδT细胞替代γδDNT细胞进行探讨,γδT细胞与TCRγδ（-）PBMC以0：8、1：8、1：4和1：2混合,随着γδδT细胞比重的增加,γδDNT细胞比重增加,Core诱导αβCD8+T细胞产生IFN-γ （Friedman test, P=0.026）和TNF-α （Friedman test,P=0.044）的细胞频数下降。4.3不同γδT细胞频数对CD8+T细胞非特性活化产生IFN-γ的影响：γδT细胞（γδDNT/γδT>80%）与TCRγδ（-）PBMC以0:16、1:16、1:4、1:2和1：1混合,随着γδT细胞的比重的提高,γδDNT细胞增加,anti-CD3诱导的CD8+T细胞产生IFN-γ能力下降（Friedman test,P=0.007,n=4）。4.4不同γδT细胞频数对CD8+细胞非特异性增殖的影响：γδT细胞（γδDNT/γδT>80%）与CFSE标记的TCRγδ（-）PBMC以0:16、1:16、1:4、1:2和1：1混合,以CD4+T细胞为对照,随着γδT细胞的比重的提高anti-CD3诱导的CD8+T细胞的增殖百分比下降（Friedman test,P=0.003,n=4）。5.CHB中DNT细胞的免疫学特征：比较CD69和HLA-DR在αβDNT细胞、γδDNT细胞和CD4+/CD8+T细胞之间的表达频数,αβDNT细胞显着高表达活化分子CD69（overall P>0.001）和HLA-DR（overall P=0.001）;比较CD69和HLA-DR在αβDNT细胞和γδDNT细胞上的表达频数早HC（n=13）、CHB（n=12）和IT（n=9）之间的差别,CHB中CD69在αβDNT细胞（P=0.007）和γδDNT细胞（P=0.008）的表达均高于HC组（n=13）,而γδDNT细胞在CHB（P=0.007）和IT（P=0.001）中更多表达HLA-DR,提示DNT细胞亚群在CHB中活化程度更高。在CHB中,αβDNT细胞表达PD-1（n=5, overall P=0.015）和PD-L1（n=5,overall P=0.021）的频数比起γδDNT细胞或CD8+T细胞都高,而γδDNT细胞表达的CD160或BTLA频数比其他细胞亚群高（n=5, overall P=0.009）, NKG2A在γδDNT细胞的表达频数甚至比NK细胞都高（n=7,P=0.018）,在γδDNT细胞上的各抑制分子表达频数在CHB和HC之间暂没发现有显着差异（n≤7,数据未显示）,另外各DNT细胞亚群未测及明显的LAG-3、FasL和CD107的表达。对潜在的细胞因子分泌功能研究中,10例CHB的全血中有5例在无体外刺激下测及αβDNT细胞能产生TGF-β,而IFN-γ、IL-21、IL-10或IL-17未测及；在PMA刺激下,所有患者的αβDNT细胞均能产生TGF-γ,少量产生IFN-γ、相反γδDNT细胞能显着产生IFN-γ,而未测及明显的IL-10、IL-21或IL-17。6.重组表达HBeAg （rHBeAg）体外刺激能提高非应答者来源的γδDNT细胞频数。15例非应答者来源的PBMC在rHBeAg刺激培养下与空白刺激（P=0.029）和rHBcA刺激（P=0.004）比较,rHBeAg能提高增殖T细胞中γδDNT细胞频数,而对αβDNT细胞（P=0.262）或CD4+/CD8+γδT细胞（P=0.175）没有显着影响；在11例应答者来源的PBMC中,αβDNT细胞和γδDNT细胞在空白刺激、rHBcAg和rHBeAg之间的没有统计学差异。结论1.外周血αβDNT细胞频数与LDT治疗52周后的血清学转换不相关,但其在CHB组中高于HC组和IC组,CHB中αβDNT细胞活化的程度较高,突出高表达PD-1和PD-L1分子,是分泌TGF-β的主要细胞群,提示在CHB中起免疫调节作用。2.本研究的重要发现的是γδDNT细胞与对HBV免疫控制相关,横向研究和纵向研究提示高水平γδDNT细胞不利于对HBV的免疫控制。3.本研究中,LDT治疗过程中基线和12w低水平γδDNT频数可预测抗病毒治疗的疗效。4.体外实验进一步提示γδDNT细胞能抑制非特异性的CD8+T细胞应答和HBV特异性CD8+T细胞应答,且γδDNT频数越高,抑制程度越大,一定程度上解释了临床研究中不同γδDNT细胞频数对HBV免疫控制的影响。5.γδDNT细胞突出表达免疫共抑制分子CD160、BTLA和NKG2A,与其免疫抑制作用可能相关。6.体外实验初步发现rHBeAg能提高非应答者中γδDNT细胞的频数,而对应答者则没影响,结合临床治疗过程中应答者γδDNT细胞没有明显变化,可能的解释是非应答者体内有一群HBeAg敏感的γδDNT细胞,但临床研究提示病毒因素对γδDNT细胞的影响可能不是主要因素。

吴健林^[8]（2012）在《HLA-DRB1等位基因在广西肝癌高发区民族分布状况及其对肝癌家族聚集性的影响》文中指出目的探讨人类白细胞相关抗原复合体的DRB1（HLA-DRB1）等位基因多态性在广西肝癌高发区民族的分布状况,阐明HLA-DRB1等位基因多态性对广西肝癌高发区肝癌家族聚集性的影响,为寻找原发性肝癌的易感或拮抗基因提供线索。方法以配对方法选取广西肝癌高发区的肝癌高发家族成员（来自33个肝癌高发家族）、肝癌单发家族成员（来自37个肝癌单发家族）及无癌家族成员（来自59个无癌家族）各153例作为研究对象,应用聚合酶链反应/序列特异性引物（PCR-SSP）方法检测HLA-DRB1*07、09、11、12、13、14和15等位基因,应用统计学方法分析各等位基因在广西肝癌高发区民族的分布状况及其与原发性肝癌家庭聚集性的相关性。结果（1）HLA-DRB1*07.09.11.12.13.14.15等位基因在瑶族、壮族和汉族三组人群的分布分别为：HLA-DRB1*07分别为1.8%、0.9%和3.5%（χ2=3.156,P=0.206）；HLA-DRB1*09分别为18.9%、22.1%.14.9%（χ2=2.578,P=0.276）；HLA-DRB1*11分别为9.0%、10.3%.7.0%（χ2=0.971,P=0.615）；HLA-DRB1*12分别为11.7%、17.5%.25.4%（χ2=7.256,P=0.027）；HLA-DRB1*13分别为0.9%、5.3%、5.1%（χ2=3.873,P=0.144）;HLA-DRB1*14分别为42.3%、21.9%、25.6%（χ2=13.702,P=0.001）;HLA-DRB1*15分别为35.1%、41.5%、43.0%（χ2=1.701,P=0.427）。HLA-DRB1*12和HLA-DRB1*14在瑶、壮、汉三个民族成员之间的分布有显着性差异（P<0.05）。（2）HLA-DRB1*07等位基因在肝癌高发家族成员组、肝癌单发家族成员组和无癌家族成员组的基因频率分别为0.7%、2.0%、和2.6%（P>0.05）；HLA-DRB1*09分别为19.0%、23.5%和16.3%（P>0.05）；HLA-DRB1*13分别为2.6%、6.5%和3.8%（P>0.05）；HLA-DRB1*14分别为35.3%、28.1%和22.9%（P>0.05）；HLA-DRB1*15分别为43.1%、42.5%和35.3%（P>0.05）；HLA-DRB1*11分别为2.6%、13.7%和11.1%（P=0.001,P<0.01）；HLA-DRB1*12分别为15.7%,13.7%和24.8%,（P=0.036,P<0.05）。经统计分析,HLA-DRB1*1和HLA-DRB1*12在肝癌高发家族成员组、单发家族成员组、无癌家族成员组之间的阳性率有显着性差异（P<0.05）。（3）HLA-DRB1*07、09、11、12、13、14、15等位基因在乙型肝炎病毒感染成员组（HBsAg阳性组）及非乙肝病毒感染成员组（HBsAg阴性组）中的基因频率分别为：HLA-DRB1*07为0%、2.6%（χ2=1.701,P=0.427）；HLA-DRB1*09分别为19.0%、19.9%（χ2=0.043,P=0.836）;HLA-DRB1*11分别为9.5%、9.0%（χ2=0.036,P=0.849）；HLA-DRB1*12分别为17.9%、18.4%（χ2=0.012,P=0.913）；HLA-DRB1*13分别为2.7%、4.8%（χ2=1.096,P=0.295）；HLA-DRB1*14分别为25.9%、30.1%（χ2=0.893,P=0.345）；HLA-DRB1*15分别为39.4%、42.2%（χ2=0.315,P=0.575）,HLA-DRB1的7个等位基因在两组成员间的基因频率无显着性差别。结论（1）HLA-DRB1*15和HLA-DRB1*14两个等位基因在广西肝癌高发区中瑶、壮和汉三个主要民族中属于高频率基因,HLA-DRB1*13和HLA-DRB1*07为低频基因；HLA-DRB1*12和HLA-DRB1*14两等位基因在瑶族、壮族和汉族三大民族的分布中有其各自的民族特色。（2）HLA-DRB1*11、HLA-DRB1*12两个等位基因可能是广西肝癌高发区原发性肝癌发生的拮抗基因,其缺失可能是导致广西肝癌高发区肝癌家族聚集性原因之一。（3）HLA-DRB1*07、09、11、12、13、14、15等位基因与广西肝癌高发区乙肝病毒感染的易感性似乎无明显关联。（4）进一步分析结果提示,HLA-DRB1*11、HLA-DRB1*12两个等位基因可能不是通过降低机体对乙肝病毒的易感性从而减少对原发性肝癌的易感性,而可能是此两个基因通过其他免疫机制发挥其抗癌作用。

张卿^[9]（2012）在《HBx蛋白和CIITA转录表观遗传沉默在调控HepG2与L02细胞HLA-DR表达中的作用研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染已成为全球范围的严重公共卫生问题。HBV感染与原发性肝细胞癌关系密切，是我国原发性肝细胞癌的主要病因之一，而HBV感染导致肝癌发生、发展的确切机制至今尚未阐明。宿主免疫应答水平是影响肿瘤发生、发展与转归的主要因素之一。肝癌细胞免疫逃逸在原发性肝癌的发生、发展中发挥了重要作用，探讨肝癌细胞的免疫逃逸机制有助于制定针对肝癌免疫治疗的策略。主要组织相容性II类分子（major histocompatibilitycomplex II，MHC-II）通过向Th细胞提呈外来抗原，在抗感染和抗肿瘤免疫中起重要作用。现有研究表明，肿瘤细胞缺乏HLA-DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）表达是乳腺癌、结肠癌等发生免疫逃逸的重要机制之一。II类反式激活因子（Class IItransactivator，CIITA）是调控HLA-DR表达的“限速因子”，在调控HLA-DR表达与否及水平中起决定作用。报道指出，胃癌、结肠癌等肿瘤细胞中CIITA表达缺失是其缺乏诱导性HLA-DR表达的关键机制。我们以前的研究发现，HBV相关原发性肝细胞癌患者癌组织中的肝癌细胞缺乏CIITA与HLA-DR表达，而相应的癌周肝组织中的肝细胞存在不同程度的CIITA与HLA-DR表达，提示肝癌细胞缺乏HLA-DR表达可能与CIITA基因表达沉默有关、并在肝癌细胞免疫逃逸中起重要作用。然而，肝癌细胞CIITA基因表达沉默的机制尚未阐明。宿主基因启动子DNA甲基化和/或组蛋白的去乙酰化是导致宿主基因表达沉默的重要机制。已有研究显示，部分肿瘤细胞CIITA启动子IV甲基化和/或组蛋白去乙酰化是导致肿瘤细胞CIITA表达沉默和HLA-DR表达缺乏的关键表观遗传机制。在不同的肿瘤细胞中，导致CIITA基因转录沉默的表观遗传机制存在差异，在黑色素瘤细胞中由其启动子IV组蛋白去乙酰化所致，与甲基化无关；在胃癌、结肠癌细胞中则由其启动子IV甲基化单独所致；在白血病细胞中则由其启动子IV甲基化和组蛋白去乙酰化共同调控。在肝癌细胞中，与HLA-DR表达缺失相关的CIITA基因表观遗传沉默机制目前尚缺少研究。HBV基因组含有4个开放读码框架，其中X区所编码的产物HBx蛋白是一种多功能的调节蛋白，具有广泛的反式激活功能，既可激活信号转导系统，又可直接作用于细胞转录因子，还能通过上调DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶等的表达参与宿主基因的表观遗传调节，导致宿主基因的表观遗传沉默。近年研究发现X基因及其产物X蛋白与原发性肝细胞癌的发生密切相关，而HBx蛋白对抑癌基因的表观遗传修饰调控导致的基因沉默被认为是原发性肝细胞癌发生、发展的重要机制。由此推测，HBx蛋白有可能通过上调DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶等的表达参与诱导肝细胞或肝癌细胞CIITA基因转录表观遗传沉默。然而，HBx蛋白在调控肝细胞CIITA基因转录表观遗传沉默与HLA-DR表达中的作用尚无研究报道。首先，我们检测人正常肝细胞株L02细胞和人肝癌细胞株HepG2细胞中基础性及IFN-γ诱导性CIITA和HLA-DR的表达状况，并分析CIITA基因cDNA转染对HepG2细胞HLA-DR表达的影响，从而探讨HepG2细胞缺乏HLA-DR表达与CIITA基因表达沉默的关系；然后，采用MSP和ChIP技术检测L02细胞和HepG2细胞中CIITA启动子IV的DNA甲基化和组蛋白H3乙酰化状态，并分析甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达的影响，从而探讨CIITA启动子IV DNA甲基化和组蛋白H3去乙酰化在调控HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达中的作用；最后，构建HBV X基因真核表达载体，并分别转染L02细胞与HepG2细胞，探讨HBx蛋白对L02细胞与HepG2细胞CIITA和HLA-DR表达的影响。主要研究结果1、L02细胞中未检测到CIITA和HLA-DR的基础性表达，通过IFN-γ的刺激后检测到了CIITA和HLA-DR mRNA和蛋白的表达，且CIITA和HLA-DR的表达与IFN-γ呈一定的时间剂量依赖关系。HepG2细胞中，则未检测到CIITA和HLA-DR的基础性及IFN-γ诱导性表达。通过将CIITA真核表达载体转染HepG2细胞后，检测到HLA-DR的表达，转染空载体及HepG2细胞本身未检测到HLA-DR的表达。2、L02细胞中CIITA启动子IV DNA呈非甲基化状态，组蛋白H3呈乙酰化状态，HepG2细胞中CIITA启动子IV DNA呈半甲基化状态，组蛋白H3呈去乙酰化状态。通过采用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA单独及联合处理HepG2细胞后，结果显示TSA和5-Aza-CdR单独处理及两者联合处理，均能恢复IFN-γ诱导性CIITA mRNA的表达，以TSA单独处理组相对定量为1，5-Aza-CdR单独处理组相对值为1.15±0.27，两者联合处理组相对定量值为2.13±0.22，显着高于单独处理组，P＜0.05；经5-Aza-CdR处理后恢复了HLA-DR蛋白的诱导性表达，经流式细胞技术检测，其表达率达11.9%±1.78%；经TSA处理后，HLA-DR蛋白的诱导性表达率达9.31%±2.24%；经两者联合处理后，HLA-DR蛋白的诱导性表达率达28.5%±2.81%，较两者单独处理明显升高（P＜0.05）。3、构建HBV X基因真核表达载体，通过电穿孔方法转染L02细胞和HepG2细胞后，转染了HBV X基因的L02细胞中检测到了CIITA和HLA-DR的表达，同时，转染了HBV X基因的HepG2也检测到了HLA-DR的表达。结论1、CIITA基因表达沉默是导致HepG2细胞缺乏基础性与IFN-γ诱导性HLA-DR表达的关键机制；2、CIITA启动子IV的DNA甲基化和组蛋白H3去乙酰化修饰在导致HepG2细胞CIITA基因转录表观遗传沉默及HLA-DR表达缺失中均起重要作用，并可能是导致肝癌细胞免疫逃逸的重要机制；3、HBx蛋白能诱导L02和HepG2细胞CIITA与HLA-DR表达，提示HBV相关性肝癌细胞CIITA表观遗传沉默所致的HLA-DR表达缺失与HBx蛋白无关。

张卿,李俊刚,刘玉元,赵博,张绪清^[10]（2012）在《9HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响》文中认为目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein,EGFP）表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为（6.4±3.5）%,显着低于电穿孔法（41.46±5.8）%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBVX蛋白表达水平为（5.1±3.9）%,显着低于电穿孔方法（37.5±4.1）%表达,P<0.01。转染了HBVX基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。

二、乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应（论文提纲范文）

（1）肾组织中与狼疮性肾炎相关的失调基因生物信息学分析鉴定（论文提纲范文）

（2）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）

（3）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）

（4）HBV相关慢加急性肝衰竭的全基因组关联研究及主要位点HLA-DR功能解析（论文提纲范文）

（5）HLA-DRB1*09/12/15等位基因对广西HBV相关性肝病的影响研究（论文提纲范文）

（6）HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响（论文提纲范文）

（7）CD4-CD8-双阴性T细胞在慢性乙型肝炎及抗病毒治疗中的免疫学研究（论文提纲范文）

（8）HLA-DRB1等位基因在广西肝癌高发区民族分布状况及其对肝癌家族聚集性的影响（论文提纲范文）

（9）HBx蛋白和CIITA转录表观遗传沉默在调控HepG2与L02细胞HLA-DR表达中的作用研究（论文提纲范文）

四、乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应（论文参考文献）

• [1]肾组织中与狼疮性肾炎相关的失调基因生物信息学分析鉴定[D]. 王晓雨. 南昌大学, 2021(01)
• [2]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
• [3]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)
• [4]HBV相关慢加急性肝衰竭的全基因组关联研究及主要位点HLA-DR功能解析[D]. 谭文婷. 第三军医大学, 2016(11)
• [5]HLA-DRB1*09/12/15等位基因对广西HBV相关性肝病的影响研究[D]. 韦柯利. 广西医科大学, 2013(S1)
• [6]HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响[J]. 张卿,李俊刚,刘玉元,赵博,张绪清. 第三军医大学学报, 2012(10)
• [7]CD4-CD8-双阴性T细胞在慢性乙型肝炎及抗病毒治疗中的免疫学研究[D]. 赖钦涛. 南方医科大学, 2012(07)
• [8]HLA-DRB1等位基因在广西肝癌高发区民族分布状况及其对肝癌家族聚集性的影响[D]. 吴健林. 广西医科大学, 2012(09)
• [9]HBx蛋白和CIITA转录表观遗传沉默在调控HepG2与L02细胞HLA-DR表达中的作用研究[D]. 张卿. 第三军医大学, 2012(01)
• [10]9HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响[A]. 张卿,李俊刚,刘玉元,赵博,张绪清. 第二届全国病毒性肝炎慢性化重症化基础与临床研究进展学术会议论文汇编, 2012

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