一、维甲酸诱导神经管畸形发生过程中神经干细胞的变化研究（论文文献综述）
李建婷[1]（2021）在《叶酸缺乏致神经管畸形易感基因双链断裂的表观特征及新易感基因筛选》文中研究表明目的:利用高通量测序中的表观组学测序联合转录组学测序技术交互分析研究叶酸缺乏导致神经管畸形（Neural tube defects,NTDs）易感基因发生DNA双链断裂（DNA double-strand break,DSB）区域的染色质的表观特征;根据以上NTDs易感基因的表观特征进一步筛选新的NTDs易感基因,以期为叶酸缺乏导致NTDs发生提供新的理论支撑与研究基础。方法:1、利用叶酸拮抗剂甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）处理小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESCs）24h后,收集mESCs进行组蛋白修饰H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3、H3K27ac以及CTCF的ChIP-seq测序,并利用ChroHMM软件对染色质状态进行表征;2、基于课题组前期研究基础利用超几何算法计算MTX诱导mESCs基因组发生DSB区域的表观修饰特征改变;3、利用MTX处理mESCs 24h后,收集mESCs后提取mRNA后进行转录组的RNA-seq测序,分析NTDs易感基因的转录改变与基因组DSB区域表观修饰改变之间的关系;4、利用MTX处理mESCs 24h后,收集mESCs进行ATAC-seq测序,分析基因组染色质的开放性与DSB发生之间的联系;5、联合生物信息学方法分析MTX诱导NTDs易感基因发生DSB的同时伴随的表观修饰特征,并根据该特征筛选新的NTDs易感基因;6、在人低叶酸NTDs胎儿脑组织中通过Nanostring实验验证以上新筛选的NTDs易感基因的转录改变。结果:1、MTX诱导mESCs基因组的DSB主要发生在基因的启动子和增强子区。2、MTX诱导mESCs基因组活性启动子区发生DSB的同时伴随着染色质表观修饰的改变。3、MTX诱导mESCs基因组活性增强子区发生的DSB可以影响启动子活性。4、MTX诱导mESCs基因组的DSB通过CTCF介导的拓扑异构区改变NTDs易感基因的转录。5、根据以上调控模式共筛选出12个新的NTDs易感基因,其中7个基因在PABPC4、MED13L、TPGS1、FAM208A、SF3B5、BMYC、FAM109A在NTDs标本脑组织中得到验证。结论:1、MTX诱导的基因组启动子区发生DSB后导致基因组该区域染色质结构的改变进而影响NTDs易感基因的表达。2、MTX诱导的基因组远端增强子区发生DSB后影响其与启动子之间的相互作用进而导致基因表达紊乱。3、PABPC4、MED13L、TPGS1、FAM208A、SF3B5、BMYC、FAM109A是NTDs的新易感基因。
杨婵娟[2]（2021）在《基于PI3K/Akt信号通路研究五子衍宗丸防控神经管畸形的机制》文中指出目的:本课题拟测定五子衍宗丸（WYP）中叶酸（FA）的含量,排除固有叶酸干扰,研究五子衍宗丸对神经管畸形（NTDs）的防控作用,并通过叶酸与排除叶酸干扰的五子衍宗丸比较,从动物水平和细胞水平研究五子衍宗丸防控神经管畸形的机制,为今后应用WYP预防NTDs提供科学的理论依据。方法:利用LC-MS测定WYP水蜜丸与免煎颗粒中FA的含量。C57BL/6小鼠90只,按雌︰雄=2︰1合笼,检测到阴栓者为孕鼠,并将其随机分为正常组、模型组、叶酸组（FA组）、五子衍宗丸组（WYP组）和等剂量叶酸+五子衍宗丸组（FA+WYP组）,每组各12只,同时给予药物干预,孕7.5天采用全反式维甲酸（atRA）建立NTDs动物模型（正常组除外）,孕11.5天处死孕鼠,取出子宫,分离胚胎,体视显微镜下鉴定神经管畸形,并统计畸形率。HE染色观察小鼠神经管闭合情况;TUNEL染色检测组织切片细胞凋亡率。CHO细胞和CHO/dhFr-细胞各分为正常组、模型组、FA组、WYP组和FA+WYP组。FA组加入含FA溶液的培养基,WYP组加入含WYP溶液的培养基,FA+WYP组加入含有此二者的培养基,正常组和模型组加入与其他组等体积的培养基。24h后除正常组外,其余四组分别加入含atRA溶液的培养基并使其最终浓度为20μmol/L,正常组加入与其他组等体积的培养基。流式细胞术检测细胞凋亡率。基于PI3K/Akt信号通路,检测通路指标PI3K、Akt、P-Akt和Nrf2,氧化应激指标SOD、CAT、GSH和GSH-Px以及细胞凋亡相关指标Bax、Bcl-2的表达水平。结果:1.利用LC-MS测定WYP中FA的含量观察LC-MS图谱,对比三幅图,FA主特征峰的保留时间为3.14min,WYP水蜜丸与免煎颗粒在3.14min没出峰,表明在WYP中未检测出FA,可以确定WYP对NTDs的防控作用与FA无关。2.WYP对NTDs动物模型的影响2.1 WYP对NTDs胚胎形态学的影响2.1.1体视显微镜下鉴定神经管畸形。正常组孕鼠子宫未见充血,吸收胎较罕见,镜下观胚胎神经管闭合良好,脑泡发育完整,有胎心搏动;模型组孕鼠子宫充血,其胚胎呈现NTDs,可出现颅脊柱裂畸形、无眼畸形、单眼畸形、面部畸形等,吸收胎多见,镜下观察,其发育多不完整,且较正常胚胎发育迟缓,其中颅脊柱裂畸形胚胎未见到完整的脑泡。2.1.2 HE染色观察胚胎神经管闭合情况。正常组胚胎神经管完全闭合,神经上皮发育良好,镜下可见神经上皮层、边缘层、套层,结构清晰完整,顶板闭合;模型组胚胎神经管闭合不全,神经上皮层较为稀薄,边缘层消失,结构模糊,顶板未闭。2.2 WYP对NTDs胚胎PI3K/Akt信号通路的影响Western Blot结果显示,与正常组比较,模型组PI3K、P-Akt和Nrf2蛋白表达显着降低（P<0.01）;与模型组比较,FA组、WYP组和FA+WYP组PI3K、P-Akt和Nrf2蛋白表达呈不同程度升高（P<0.05;P<0.01）;与FA组比较,WYP组PI3K、P-Akt和Nrf2蛋白表达明显升高（P<0.05;P<0.01）;与WYP组比较,FA+WYP组PI3K、P-Akt和Nrf2蛋白表达无统计学差异（P>0.05）。2.3 WYP对NTDs胚胎氧化应激的影响与正常组比较,模型组GSH含量,CAT蛋白表达,SOD和GSH-Px活力显着降低（P<0.01;P<0.001）;与模型组比较,FA组、WYP组和FA+WYP组GSH含量,CAT蛋白表达,SOD和GSH-Px活力呈不同程度升高（P<0.05;P<0.01）;与FA组比较,WYP组GSH含量,CAT蛋白表达,SOD和GSH-Px活力明显升高（P<0.05）;与WYP组比较,FA+WYP组GSH含量,CAT蛋白表达,SOD和GSH-Px活力无明显差异（P>0.05）。2.4 WYP对NTDs胚胎细胞凋亡的影响2.4.1 TUNEL染色检测组织切片细胞凋亡率。与正常组比较,模型组凋亡率显着升高（P<0.01）;与模型组比较,FA组、WYP组和FA+WYP组凋亡率呈不同程度降低（P<0.05;P<0.01）;与FA组比较,WYP组凋亡率明显降低（P<0.05）;与WYP组比较,FA+WYP组凋亡率差异不明显（P>0.05）。2.4.2细胞凋亡相关指标Bcl-2、Bax的蛋白表达水平。Western Blot结果显示,与正常组比较,模型组Bcl-2蛋白表达显着降低,Bax蛋白表达显着升高,Bcl-2/Bax比值降低（P<0.01;P<0.001）;与模型组比较,FA组、WYP组和FA+WYP组Bcl-2蛋白表达呈不同程度升高,Bax蛋白表达呈不同程度降低,Bcl-2/Bax比值呈不同程度升高（P<0.05;P<0.01）;与FA组比较,WYP组Bcl-2蛋白表达显着升高,Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05;P<0.01）;与WYP组比较,FA+WYP组Bcl-2、Bax的蛋白水平,Bcl-2/Bax比值差异无统计学意义（P>0.05）。3.WYP对CHO细胞和CHO/dhFr-细胞的影响3.1 WYP对CHO细胞和CHO/dhFr-细胞氧化应激的影响与正常组比较,模型组GSH含量,SOD、CAT和GSH-Px活力显着降低（P<0.01）;与模型组比较,CHO细胞FA组、WYP组和FA+WYP组GSH含量,SOD、CAT和GSH-Px活力呈不同程度升高（P<0.05;P<0.01）,CHO/dhFr-细胞WYP组和FA+WYP组GSH含量,SOD、CAT和GSH-Px活力显着升高（P<0.05）,FA组无差异;与FA组比较,CHO细胞WYP组SOD、CAT活力升高（P<0.05）,GSH含量、GSH-Px活力无差别（P>0.05）;CHO/dhFr-细胞WYP组GSH含量,SOD、CAT和GSH-Px活力明显升高（P<0.05）;与WYP组比较,FA+WYP组GSH含量,SOD、CAT和GSH-Px活力均无明显差异（P>0.05）。3.2 WYP对CHO细胞和CHO/dhFr-细胞凋亡的影响Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。与正常组比较,模型组凋亡率显着升高（P<0.01）;与模型组比较,CHO细胞FA组、WYP组和FA+WYP组凋亡率降低（P<0.05）,CHO/dhFr-细胞WYP组和FA+WYP组凋亡率明显降低（P<0.05）,FA组无差异;与FA组比较,WYP组凋亡率明显降低（P<0.05）;与WYP组比较,FA+WYP组凋亡率差异不明显（P>0.05）。结论:1.WYP水蜜丸与免煎颗粒中均未检测出FA,可以排除WYP中固有FA的干扰。2.WYP对atRA诱导的NTDs小鼠具有良好的预防效果,WYP可以明显改善小鼠胚胎神经管的闭合情况,有效降低NTDs发病率,且WYP的预防效果优于FA。3.WYP调节PI3K/Akt信号通路,使Akt磷酸化,激活下游的转录因子Nrf2,并且WYP的效果好于FA,从而发挥抗氧化应激、抗细胞凋亡的作用。4.WYP能够改善atRA诱导的NTDs小鼠、CHO细胞模型和CHO/dhFr-细胞模型的氧化应激状态,升高GSH的含量,增加SOD和GSH-Px的活力,上调CAT的表达,且WYP的效果优于FA,从而缓解机体和细胞损伤。5.WYP能够抑制atRA诱导的NTDs小鼠、CHO细胞模型和CHO/dhFr-细胞模型的凋亡途径,有效降低细胞凋亡率,升高Bcl-2的蛋白表达,降低Bax的蛋白表达,增加Bcl-2/Bax的比值,且WYP的效果优于FA,从而减少神经管细胞的过度凋亡。
陈娜[3]（2021）在《Notchl对全反式维甲酸诱导的神经管缺陷和神经干细胞分化的影响》文中提出研究背景神经管缺陷（neural tube defects,NTDs）是一种严重的先天性脑发育缺陷,它们是由于胚胎时期神经管发育过程中的闭合异常引起,主要表现为脑的缺失、脑的扩张、脑膜的扩张和隐性脊柱裂。神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）参与神经管闭合,它的增殖、分化和迁移是神经管正常闭合的关键,NSCs的分化异常导致脑发育异常。NSCs是神经系统中最不稳定的细胞,具有自我更新性和多能性,能分化产生三种基本的神经外胚层谱系。NSCs在其整个生命周期中以区域和阶段相适应的方式产生神经元（neuron）、星形胶质细胞（astrocyte）和少突胶质细胞（oligodendrocyte）。在各种细胞命运调控通路中,Notch信号通路在细胞增殖、分化及胚胎发育中起着精密而复杂的调控作用。Notch信号通路是进化上高度保守的通路,它在多细胞动物及人类的多种细胞分化过程中发挥作用。脊椎动物Notch信号通路是由 Notch 受体[Notch1（N1）-Notch4],Notch 配体（DSL,Delta1-Delta4）和锯齿状配体（Jagged1-Jagged2）以及DNA结合蛋白RBPjk/CBF1组成。Notch受体的胞外端与配体结合激活后,会产生两个连续的蛋白水解过程,第一是胞外域S2切割位点[1],第二是发生在膜内S3的切割位点,随后Notch胞内段（intracellular domain of Notch,NICD）被释放进入细胞核,随后与DNA结合蛋白形成复合物,该复合物进一步调控下游靶基因从而调控细胞增殖分化。研究表明,Y-内分泌酶是参与Notch受体在S3切割位点关键,而早老素1（presenilin 1,PS1）是γ-内分泌酶复合体的催化活性中心[2]。全反式维甲酸（all-trans Retinoic Acid,atRA）是维甲酸在人体内的正常代谢产物,是胚胎发育的重要因素。研究发现,atRA过量会导致NTDs的发生,但其具体的分子机制尚未得到明确的研究。本研究证实了 Notch1在atRA处理小鼠胚胎脑组织（体内）和NSCs（体外）中的作用。此外,我们还首次证明了atRA通过抑制PS1从而降低Notch1信号通路活性,从而促进NSCs分化,进一步揭示了atRA引起NTDs的分子机制。该研究为神经干细胞的应用和出生缺陷的临床预防提供新的方向。第一部分小鼠神经管缺陷模型的建立及Notch1在atRA诱导的神经管缺陷中的作用机制研究目的本部分旨在建立小鼠神经管缺陷模型,在模型基础上探讨Notch1在全反式维甲酸（atRA）诱导的神经管缺陷（NTDs）中的作用机制。研究方法将C57BL/6雌鼠随机分成实验组和对照组,实验组孕第7天给予100 mg/kg的atRA灌胃,对照组孕第7天给予相同体积玉米油灌胃,孕鼠于孕11、13、15、17日处死后取胎鼠,对其大脑进行苏木精和伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色检测脑发育异常情况。通过免疫荧光和Western blot检测小鼠胚胎脑内Notch1表达部位和表达量。研究结果atRA可诱导小鼠胚胎的脑发育异常。与对照组相比,暴露于atRA组的胚胎更早显示出对称的脑实质形成,且脑实质生长更加明显,可以诱导神经管畸形模型建立。Notch1存在于胚胎小鼠脑组织的神经上皮层,统计学分析结果提示atRA处理组的小鼠胚胎脑组织中Notch1表达明显低于对照组。研究结论atRA能够诱导建立小鼠胚胎的神经管缺陷模型,同时抑制胚胎脑组织神经上皮层Notch1的激活而促进神经管的分化,导致NTDs。第二部分Notch1对atRA诱导的神经干细胞分化中的作用研究目的1.本部分旨在进行神经干细胞的分离和培养,鉴定神经干细胞及分化产生的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,并检测Notch1在上述细胞中的分布。2.用atRA处理神经干细胞,检测Notch1、PS1和神经干细胞分化产生的各种细胞标记物的表达,研究Notch1、PS1与atRA处理的神经干细胞分化中的分子机制。研究方法1.取孕18.5天胎鼠的大脑提取原代神经干细胞,用含有10%胎牛血清的分化培养基对神经干细胞进行诱导分化。2.通过免疫荧光的方法鉴定Notch1与神经干细胞标记物-巢蛋白（Nestin）、神经元标记物-神经丝蛋白（neurofilament,NF）、星型胶质细胞标记物-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）及少突胶质细胞标记物-半乳糖（基）神经酰胺酶（galactosylceramidase,GALC）在神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达。3.通过Western blot方法检测atRA处理组和对照组NSCs中Notch1、PS1、NF、GFAP、GALC的含量在培养第1天（D1）,第3天（D3）,第5天（D5）和第7天（D7）表达的变化。研究结果1.原代神经干细胞培养显示神经细胞分化的整个过程。分化培养0天时,可见神经球附着与瓶底。培养1天时,神经球体积增大,可见少量NSCs从神经球中释放,开始复制分裂。培养3天时,不同类型的细胞出现在神经球周围,单个细胞伸出条索状突起。培养7天时,可检测到不同形状的细胞,包括神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。2.免疫荧光染色中细胞标志蛋白Nestin、NF、GFAP及GALC荧光成阳性,说明神经干细胞分化出神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。同时检测到神经干细胞及分化细胞中Notch1与Nestin、NF、GFAP及GALC共表达。3.对照组中Notch1和PS1表达水平有规律的下降,但NF、GFAP和GALC的表达水平逐步升高,提示Notch1表达的降低在一定程度上显着促进了神经干细胞的分化。atRA处理组,Notch1和PS1的表达水平逐渐降低,而NF、GALC和GFAP的表达水平显着升高,提示atRA提高NSCs的分化能力,atRA处理NSCs后通过抑制PS1逐渐降低Notch1表达。研究结论1.NSCs及其分化的神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞中存在Notch1的表达。2.atRA处理神经干细胞后,通过抑制PS1降低Notch1信号通路活性促进神经干细胞分化。
马玲[4]（2021）在《神经干细胞源外泌体促神经元分化作用与机制的实验研究》文中指出目的:神经管畸形（Neural tube defects,NTDs）是中枢神经系统最常见的先天性缺陷。手术治疗仅能修复组织缺损,但是对于神经功能的修复效果不佳。而细胞治疗既能够修复组织缺损又能进行神经元重建。我们课题组前期实验在NTDs大鼠的胚胎中移植骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,发现定植于缺损部位的BMSCs中有约20%分化为神经元。广泛认为,越高的神经元分化意味着神经损伤修复和功能恢复越好。为了获得更好的细胞治疗效果,我们探索提高BMSCs向神经方向分化的新方法。外泌体（exosomes）是由细胞分泌的双层包裹的小囊泡,含有其来源细胞的成分,因而具有其来源细胞的功能特征。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）具有自我更新和分化为神经元及神经胶质细胞的能力,因此我们推测神经干细胞源外泌体可能携带某些特异性的功能分子,诱导BMSCs向神经方向分化,从而揭示脊髓微环境对于BMSCs向神经元分化导向作用的机制,同时利用神经干细胞源外泌体提高NTDs细胞治疗时移植的BMSCs向神经元分化的效率,进而改善治疗效果。研究方法:利用Lable free质谱技术,检测神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱。通过GO分析,查找神经干细胞中具有促神经元分化功能的蛋白。利用Western Blot方法验证候选蛋白质在神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs表达水平的差异。利用蛋白质组学筛选出的Netrin1（500ng/ml）诱导NSCs分化,并利用免疫荧光染色和Western Blot检测神经元标志物Map2、NF、β3-Tubulin的表达。在GEO数据库中检索到Netrin1相关的数据集GSE54107。利用生物信息学方法筛选表达上调并且具有促进神经元分化功能的分子。利用RNAi技术与Western Blot验证,在Netrin1作用下,NSCs中Netrin1下游功能分子蛋白表达水平的变化,并阻断该分子,观察Map2、NF、β3-Tubulin蛋白表达水平的改变。BMSCs培养基中分别添加神经干细胞源外泌体及500ng/ml Netrin1,检测Map2、NF、β3-Tubulin的表达。并且对全胚胎培养（whole embryo culture,WEC）的脊柱裂胎鼠羊膜腔内单纯注射BMSCs或联合注射BMSCs与神经干细胞源外泌体,检测定植BMSCs中β3-Tubulin阳性细胞百分率的差异。数据以均值±标准差表示,采用SPSS22.0软件对实验数据进行t检验和单因素方差分析,以p值表示统计差异,p<0.05认为差异具有统计学意义。结果:⒈Lable free质谱检测神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱结果。⑴神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱全GO分析的结果显示,神经干细胞源外泌体中细胞外基质成分比例高于NSCs。⑵神经干细胞源外泌体相对于NSCs上调蛋白的GO分析结果显示,外泌体富集了具有调节NSCs分化功能的蛋白。⑶神经干细胞源外泌体全GO注释结果显示有30个蛋白在GO注释中为阳性调节神经元分化（GO:0045666）。质谱检测结果显示在30个蛋白中Netrin1、Nedd4l、Ptprz1、Fn1在神经干细胞源外泌体中表达水平高于NSCs,Pafah1b1、Camk2d、Gsk3b、Prpf19、Netrin1、Rufy3、Camk2b、Ptprz1、Reelin在神经干细胞源外泌体中蛋白表达水平高于BMSCs。⑷Western Blot验证结果显示与其来源细胞NSCs相比,Netrin1、Nedd4l富集表达于神经干细胞源外泌体中（p=0.0007、p<0.0001）,并且表达水平高于BMSCs（p=0.0004、p<0.0001）。⒉Netrin1诱导NSCs向神经元分化的实验结果。⑴500ng/ml Netrin1培养的小鼠NSCs中β3-Tubulin的阳性率高于对照组的（p<0.0001）,并且Map2、NF、β3-Tubulin蛋白水平表达上调（p=0.0068、p=0.0112、p=0.002）。⑵对Netrin1诱导i PS的RNA测序数据集GEO54107进行GO分析,在神经嵴分化（GO:0014033）功能注释下,筛选到Phox2b、Hand2、Wnt10a。PPI分析结果显示Hand2与Phox2b存在相互作用。⑶500ng/ml Netrin1培养的小鼠神经干细胞中,Phox2b、Hand2蛋白表达水平升高（p=0.0013、p=0.0023）,并且利用RNAi下调Phox2b在给予500ng/ml Netrin1诱导NSCs分化,Map2、NF、β3-Tubulin蛋白水平明显低于NC+500ng/ml Netrin1组（p=0.0001、p=0.0003、p=0.0002）。⒊体外神经干细胞源外泌体、Netrin1诱导BMSCs向神经元分化的实验结果,以及体外羊膜腔联合移植BMSCs与神经干细胞源外泌体治疗NTD胎鼠的实验结果。⑴神经干细胞源外泌体诱导BMSCs向神经元分化明显增多,β3-Tubulin阳性细胞的百分比明显高于对照组（p=0.0138）。并且神经干细胞源外泌体组中,Map2、NF、β3-Tubulin的蛋白表达水平明显上调（p=0.0033、p=0.0009、p=0.028）。⑵500ng/ml Netrin1诱导BMSCs向神经元分化明显增多,β3-Tubulin阳性细胞的百分比明显高于对照组（p<0.0001）。500ng/ml Netrin1诱导BMSCs中神经元标志物Map2、NF、β3-Tubulin蛋白表达水平明显升高（p=0.0001、p=0.0064、p=0.0061）。⑶在全胚胎培养的大鼠神经管畸形模型中,神经干细胞源外泌体与BMSCs联合治疗组的BMSCs的神经元分化率明显高于单纯BMSCs组（p<0.0001）。结论:1.神经干细胞源外泌体中携带30个促神经元分化的蛋白质,并对其中Netrin1、Nedd4l存在富集作用。2.胞外基质Netrin1能够通过上调Hand2、Phox2b促进神经干细胞向神经元分化。3.神经干细胞外泌体及外泌体中富集的Netrin1均能诱导BMSCs向神经元分化,并且能够提高NTDs细胞移植治疗时BMSCs向神经元分化的效率。
张娟[5]（2020）在《MiRNA-10a-5p靶向CHL1调控神经干细胞生物学行为及在神经管畸形发生中的作用机制研究》文中研究说明目的:神经管畸形（neural tube defects,NTDs）是由于神经管闭合不全导致的一种严重的先天畸形,其危害严重,病因复杂。Micro RNA（miRNA）在神经管发育过程中起着重要作用,其在NTDs发生中的作用尚不清楚,从miRNA的表观遗传角度深入研究NTDs的发病机制意义重大。本研究目的主要有:1从组学水平系统探讨维甲酸（retinoic acid,RA）诱导的NTDs鼠胚神经管组织中miRNA表达谱的变化情况,筛选NTDs发生相关的重要差异表达miRNAs。2研究miR-10a-5p在NTDs和正常鼠胚神经管中的表达差异,以神经干细胞（neural stem cells,NSCs）为细胞模型,探讨其在RA诱导的NTDs发生中的作用及机制。方法:1 NTDs模型的构建和小RNA组测序（small RNA sequence,s RNA-seq）1.1以C57BL/6小鼠为实验动物,于胚胎7.5天（embryonic day 7.5,E7.5）,实验组孕鼠灌胃28 mg/kg RA构建NTDs鼠胚模型,对照组孕鼠灌胃相同剂量香油。1.2于E8.5、E9.5和E10.5三个时间点（神经管闭合期）分别分离对照组和实验组鼠胚脑泡组织,在Illumina Hi Seq TM2000测序平台进行s RNA-seq,获得正常组（Brc8.5、Brc9.5和Brc10.5）和NTDs组（Bra8.5、Bra9.5和Bra10.5）miRNA表达文库。2 NTDs鼠胚miRNA表达谱分析2.1计算对照组和NTDs组文库中miRNA归一化表达的倍数变化（log2 Ratio Bra/Brc）和P值。将符合|log2 Ratio|≥1和错误发生率（false discovery rate,FDR）≤0.001标准的miRNA定义为在两组中显着差异表达的miRNA,获得Bra8.5-vs-Brc8.5、Bra9.5-vs-Brc9.5和Bra10.5-vs-Brc10.5三组文库对的差异表达miRNAs,进一步通过交集分析获得共同差异表达miRNAs。2.2用Targetscan在线数据库预测miRNA作用的候选靶基因,并对候选靶基因进行GO和KEGG pathway显着性富集分析,了解候选靶基因参与的生物学过程及信号代谢通路。2.3筛选部分NTDs相关的差异表达miRNAs进行RT-q PCR表达量验证。3基于sRNA-seq数据分析,选取miR-10a-5p这一在NTDs鼠胚中表达丰度最高、差异倍数最大的上调差异表达miRNA为本部分研究的靶点,研究其表达异常对神经细胞生物学功能的影响。3.1采用RT-qPCR技术对miR-10a-5p在NTDs鼠胚中的时空表达模式进行检测。3.2分别使用miR-10a-5p过表达慢病毒（LV-miR-10a）和miR-10a-5p mimics（mim-10a）转染NSCs和小鼠脑神经瘤细胞系Neuro-2a（N2a）,并采用RT-q PCR检测miR-10a-5p的表达情况。3.3采用Brd U法和CCK-8法检测miR-10a-5p过表达对细胞增殖的影响;采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测miR-10a-5p过表达对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用细胞免疫荧光技术检测miR-10a-5p对NSCs向星形胶质细胞（GFAP阳性细胞）和神经元（MAP2阳性细胞）分化的影响。4 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究4.1采用生物信息学预测miR-10a-5p作用的靶基因,筛选在神经系统中高表达且具有重要功能的Chl1为其候选靶基因。4.2采用双荧光素酶报告实验验证Chl1为miR-10a-5p的靶基因。4.3采用RT-q PCR和Western Blot（WB）检测RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1m RNA和蛋白的表达,采用免疫荧光技术检测胚胎脑部切片中CHL1的表达。4.4在NSCs中转染LV-miR-10a,采用RT-q PCR和WB检测靶基因Chl1的m RNA和蛋白的表达。4.5使用CHL1 si RNA转染NSCs,采用RT-q PCR和WB检测CHL1的m RNA和蛋白的表达情况。采用Brd U法检测CHL1敲低对细胞增殖的影响;采用FCM检测CHL1敲低对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用细胞免疫荧光技术检测CHL1敲低对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。4.6使用CHL1过表达腺病毒（AV-CHL1）和LV-miR-10a共转染NSCs进行回补实验,采用WB检测CHL1的表达情况。采用Brd U法检测CHL1回复表达对细胞增殖的影响;采用细胞免疫荧光技术检测CHL1回复表达对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。4.7采用WB检测RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1下游MAPK通路蛋白的表达。采用免疫组化技术检测切片中Ki67的表达;采用组织原位细胞凋亡检测技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL）检测切片中细胞的凋亡情况。4.8使用CHL1 si RNA转染NSCs,采用WB检测靶基因下游ERK/MAPK信号通路蛋白的表达情况。4.9用ERK激动剂Honokiol进行回补实验,LV-miR-10a转染NSCs后加入Honokiol,采用Brd U法检测对细胞增殖的影响;采用细胞免疫荧光技术检测对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。结果:1 NTDs模型的构建和s RNA-seq1.1在E8.5时,与对照组相比,NTDs组鼠胚神经褶皱形态异常,闭合延迟;在E9.5和E10.5时,NTDs组鼠胚脑部均可观察到发育畸形,神经管未闭合。说明使用本实验方法能够成功构建小鼠NTDs模型,其较好地模拟了无脑畸形这一临床NTDs表型。1.2对提取的RNA、c DNA文库和测序数据进行质控,表明其质量较高,能够用于后续生物信息学分析。2 NTDs鼠胚miRNA表达谱分析2.1 Bra8.5-vs-Brc8.5检测到241个差异表达miRNAs,上调11个,下调230个;Bra9.5-vs-Brc9.5检测到271个差异表达miRNAs,上调47个,下调224个;Bra10.5-vs-Brc10.5检测到213个差异表达miRNAs,上调46个,下调167个。2.2使用Targetscan预测差异表达miRNA的候选靶基因。将s RNA-seq与课题组前期在相同样本上进行的转录组测序（m RNA-seq）数据联合分析过滤靶基因,过滤后的差异表达miRNAs和靶基因结果:在Bra8.5-vs-Brc8.5中有232对miRNA-m RNA,包含147个基因和62个miRNAs;在Bra9.5-vs-Brc9.5中有1223对,包含779个基因和115个miRNAs;在Bra10.5-vs-Brc10.5中有1530对,包含853个基因和84个miRNAs。2.3对过滤后的miRNAs的靶基因进行GO功能性富集分析,我们发现各时期的靶基因涉及的生物学过程主要包括neuron fate commitment、neuron differentiation、central nervous system development、neurogenesis、nervous system development等。分析了在GO term“central nervous system development”中富集的所有靶基因及相应的miRNA-m RNA对,筛选了19个miRNA-m RNA负调控对。2.4对过滤后的miRNAs的靶基因进行KEGG pathway富集分析,我们发现这些基因主要参与ECM-receptor interaction、pathways in cancer、neuroactive ligand-receptor interaction等pathway。2.5通过对Bra8.5-vs-Brc8.5、Bra9.5-vs-Brc9.5和Bra10.5-vs-Brc10.5三组文库对进行交集分析,我们筛选到了41个共同差异表达miRNAs。分层聚类分析将miRNAs亚群分为5类。对其中5个miRNAs进行了RT-q PCR验证,其表达模式均与测序结果一致。2.6对41个共同差异表达的miRNAs和196个共同差异表达的m RNAs进行联合分析,我们筛选了8个miRNA-m RNA对,它们在3个时间点上的表达模式均呈负相关。2.7 miR-10a-5p是在NTDs鼠胚中表达丰度最高、差异倍数最大的上调差异表达miRNA,其可能与NTDs发生密切相关。3 miR-10a-5p异常表达对神经细胞生物学功能的影响3.1 RT-q PCR结果显示:miR-10a-5p在NTDs鼠胚中的表达显着高于对照组。3.2 RT-q PCR结果表明,LV-miR-10a和mim-10a分别转染NSCs和N2a后,miR-10a-5p的表达水平显着升高。3.3 Brd U和CCK-8结果显示:miR-10a-5p过表达抑制细胞的增殖能力;FCM结果表明:miR-10a-5p过表达使细胞周期阻滞,细胞被捕获在了G1期,无法进入S期;FCM结果表明:miR-10a-5p过表达诱导细胞的凋亡;免疫荧光结果表明:miR-10a-5p过表达时NSCs向星形胶质细胞分化的能力显着低于对照组。4 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究4.1生物信息学筛选miR-10a-5p的候选靶基因。4.2双荧光素酶报告实验证实:Chl1为miR-10a-5p的靶基因。4.3 WB结果显示:在RA诱导的NTDs鼠胚组织样本中CHL1蛋白表达水平降低;免疫荧光结果显示:NTDs组织样本中CHL1表达降低。4.4 NSCs中miR-10a-5p过表达后,CHL1的m RNA和蛋白水平均降低。4.5转染CHL1 si RNA可降低NSCs中CHL1 m RNA和蛋白的表达水平。Brd U结果显示:CHL1敲低抑制细胞的增殖能力;FCM结果表明:CHL1敲低使细胞周期阻滞,细胞被捕获在了G1期,无法进入S期;FCM结果表明:CHL1敲低诱导细胞的凋亡;免疫荧光结果表明:CHL1敲低时NSCs向星形胶质细胞分化的能力显着低于对照组。4.6 WB结果显示:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对CHL1表达的抑制作用;Brd U结果显示:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对细胞增殖的抑制作用;免疫荧光实验结果表明:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对细胞分化的影响。4.7 WB结果显示:在RA诱导的NTDs鼠胚组织样本中MAPK通路的蛋白的磷酸化水平降低;免疫组化结果显示:NTDs组织样本中Ki67表达降低;TUNEL结果显示:NTDs组织样本中细胞凋亡增加。4.8 CHL1 si RNA转染NSCs使其在细胞中低表达后,WB结果显示:CHL1下游ERK/MAPK信号通路的蛋白表达水平降低。4.9 WB结果显示:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对p-ERK表达的抑制作用;Brd U结果显示:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对细胞增殖的抑制作用;免疫荧光实验结果表明:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对细胞分化的影响。结论:1通过对NTDs鼠胚的miRNA表达谱进行差异表达分析、功能富集分析筛选出NTDs相关miRNAs,并分析了预测靶基因参与的生物学功能,应用RT-q PCR对部分miRNAs的表达进行了验证;筛选出miR-10a-5p在RA诱导的NTDs胚胎中异常高表达,其可能与NTDs的发生发展密切相关。2 miR-10a-5p在RA诱导的NTDs中发挥致畸作用,其通过靶向调节CHL1表达抑制下游MAPK信号通路,使细胞增殖、凋亡和分化失调,影响神经管发育。
孙雨晴[6]（2020）在《miR-222-3p靶向Ddit4调控小鼠神经管闭合机制的初步研究》文中提出目的:1.验证miR-222-3p和Ddit4基因在小鼠胚胎脑组织正常组和ATRA畸形组miRNA-Seq中的表达情况;验证miR-222-3p的靶基因是Ddit4。2.观察miR-222-3p低表达对HT-22细胞功能的影响,初步确定miR-222-3p对细胞功能的作用。3.通过干扰Ddit4表达观察miR-222-3p对Wnt信号通路及HT-22细胞功能的影响,初步探索miR-222-3p在ATRA诱导的小鼠胚胎NTDs发生过程中的作用机制。方法:1.建立小鼠胚胎NTDs模型:通过灌胃给药的方式,在C57BL/6小鼠怀孕第7.5天（E7.5）,将全反式维甲酸（ATRA）按照28 mg/Kg的剂量注入孕鼠体内,建立胚胎神经管畸形（NTDs）模型,然后继续饲养至E8.5、E9.5和E10.5时分别提取胚胎脑组织。2.验证异常表达的microRNA和基因及两者之间的关系:通过实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测正常和畸形胚胎脑组织E8.5、E9.5和E10.5 miR-222-3p和Ddit4 mRNA水平的表达情况;通过双荧光素酶报告基因技术检测miR-222-3p的靶基因;并通过脂质体分别将化学合成的miR-222-3p模拟物（mim-222）和miR-222-3p抑制剂（Anti-222）转染进HT-22细胞;并通过Real-time PCR、蛋白印迹（Western blotting）技术检测下游靶基因Ddit4的表达。3.检测干扰miR-222-3p表达后的细胞表型变化:通过脂质体将化学合成的Anti-222转染进HT-22细胞,进而检测细胞增殖（CCK-8法、Western blotting）、凋亡（流式细胞术、AO-EB、Western blotting）、细胞周期（流式细胞术）及迁移（细胞划痕实验）水平变化,实验分为三组:Con组（未加处理的HT-22细胞）、Anti-NC组（转染空载体的HT-22细胞）、Anti-222组（miR-222-3p抑制剂转染HT-22细胞）。4.检测miR-222-3p下游基因对细胞表型的影响:通过脂质体将化学合成的Ddit4小干扰RNA（siR-Ddit4）转染进HT-22细胞干扰Ddit4表达,进行细胞增殖、凋亡、周期和划痕实验。实验分为三组:Anti-NC组（转染空载体的HT-22细胞）、Anti-222组（miR-222-3p抑制剂转染HT-22细胞）和Anti-222+siR-Ddit4组（miR-222-3p抑制剂和siRNA-Ddit4共转染HT-22细胞）。5.检测Wnt信号通路相关指标的表达情况:通过Real-time PCR检测Wnt信号通路指标β-catenin、TCF4表达的变化;通过Western blotting检测Wnt信号通路指标标志蛋白β-catenin、TCF4蛋白的表达变化及下游指标C-myc、CycinD1蛋白的表达。6.统计学分析方法:用均数±标准差（X±S）表示数据,SPSS17.0软件进行统计学分析,GraphPad Prism 8软件进行数据作图,Image-J软件进行灰度值分析采用t检验比较两个样本均数间差异。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,当P<0.05差异具有统计学意义。结果:1.通过28 mg/kg全反式维甲酸灌胃,建立C57BL/6小鼠胚胎NTDs模型。采用Real-time PCR技术检测E8.5-E10.5脑组织miR-222-3p mRNA的水平变化,其中miR-222-3p在RA组表达较Con组明显降低（P<0.001）;Ddit4在RA组表达较Con组明显升高（P<0.01）;实验数据与miR-seq结果相一致。2.前期通过Targetscan、PicTar、miRanda生物信息学软件分析发现miR-222-3p的靶基因是Ddit4;双荧光素酶报告基因技术发现野生型Ddit4载体与miR-222-3p结合后双荧光素酶活性下降（P<0.001）,而突变型Ddit4载体与miR-222-3p结合后双荧光素酶活性无变化,说明miR-222-3p的下游靶基因是Ddit4;通过荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率达到80%以上,检测转染后Ddit4的表达水平变化,Ddit4在Anti-222组表达较Con组和Anti-NC组表达显着升高（P<0.001）,在mim-222组表达较Con组和mim-NC组表达显着降低（P<0.01）。3.细胞增殖结果显示:CCK-8法结果表明Anti-NC组、Anti-222组0 h时的吸光度值（OD）与Con组无明显差异,转染后的2-4天,Anti-222组OD值显着低于Con组和Anti-NC组（P<0.01）;Anti-222+siR-Ddit4组OD值显着高于Anti-222组（P<0.01）;Western blotting结果表明Anti-222组PCNA蛋白表达水平降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组PCNA蛋白表达水平较Anti-222升高（P<0.05）。4.细胞凋亡结果显示:流式结果表明Anti-222组细胞的早凋率和晚凋率显着高于Con和Anti-NC组（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组细胞的早凋率和晚凋率显着低于Anti-222组（P<0.001）;AO-EB结果表明:Anti-222中绿色和橘红色并呈固缩状或圆珠状的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞显着多于Con组和Anti-NC组（P<0.001）;Western blotting结果表明Anti-222组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显着升高（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组PCNA蛋白表达水平较Anti-222组显着降低（P<0.001）。5.细胞周期结果显示:流式结果表明Anti-222组处于G1期的细胞数显着高于Con和Anti-NC组,而处于S和G2期的细胞数,显着低于Con和Anti-NC组(PG1<0.001,PS<0.001);Anti-222+siR-Ddit4组处于G1期的细胞数显着低于Anti-222组,处于S和G2期的细胞数显着高于Anti-222组(PG1<0.001,PS<0.001)。6.细胞迁移结果显示:细胞划痕结果表明Anti-222组较Con和Anti-NC组细胞迁移能力显着降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组迁移能力较Anti-222显着增强（P<0.001）。7.Real-time PCR结果显示:Anti-222组与Con组及Anti-NC组相比,β-catenin、TCF4 mRNA表达显着降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组较Anti-222组表达显着升高（P<0.05）。8.Western blotting结果显示:Anti-222组与Con组及Anti-NC组相比,β-catenin、TCF4、C-myc、CycinD1蛋白水平表达显着降低（P<0.01）;Anti-222+siR-Ddit4组较Anti-222组表达显着升高（P<0.001）。结论:1.miR-222-3p低表达可能在ATRA诱导的NTDs发生过程中起重要作用。2.miR-222-3p的靶基因是Ddit4。3.miR-222-3p可能通过影响Ddit4表达参与Wnt信号通路引起细胞增殖和细胞凋亡、细胞迁移的异常而造成NTDs的发生。
刘玉思[7]（2020）在《神经管畸形动物模型中凋亡调控因子（miR-322、PCSK9）的表达规律及作用机制的研究》文中研究说明目的:神经管畸形（neural tube defects,NTDs）是一种常见的出生缺陷,通常是由胚胎发育早期神经管闭合不完全或者闭合失败引起的。NTDs的发病率在1‰-5‰,其危险因素涉及环境、生物、遗传、辐射和化学药品等。NTDs作为一种复杂的多基因疾病,目前尚不清楚其具体病因,其遗传因素中的基因突变或各信号通路中分子间的相互作用和表达调控机制异常,可能在NTDs的发生中起着重要作用。细胞凋亡又称细胞程序性死亡,在胚胎发育、组织器官形态形成和功能确定等生命活动中普遍存在并发挥着重要作用。研究表明,在神经管发育过程中,由于自身基因缺陷或其他因素引起的细胞凋亡相关基因的功能紊乱,打破了细胞增殖与凋亡的动态平衡,则会导致NTDs的发生。在前期研究中,我们分别发现microRNA-322（miR-322）和前蛋白转化酶枯草溶菌素9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）在NTDs中低表达:在糖尿病引起的NTDs中,mi R-322低表达,且抑制高糖诱导的小鼠神经干细胞凋亡;在对E11孕鼠血清的蛋白质组的分析中发现,与对照组相比,NTDs组中PCSK9的蛋白表达水平明显降低。这些发现提示mi R-322、PCSK9具有成为NTDs早期筛查的分子标志物及干预治疗新靶点的潜能,但其参与NTDs发生具体分子机制并不清楚。因此,本研究旨在通过全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）建立NTDs动物模型,探索miR-322和PCSK9在NTDs中的表达规律及其对细胞凋亡的影响,明确其参与NTDs发生的具体分子机制。方法:本研究分为以下两个部分:1、miR-322通过沉默NOX4参与NTDs的形成1.1使用ATRA建立小鼠NTDs模型并于胚胎发育的E9.5取材。通过qRT-PCR检测miR-322、NOX4的表达水平;通过western blot方法检测NOX4蛋白的表达水平。1.2生物信息学预测miR-322的靶基因。培养小鼠神经干细胞C17.2并转染生物素标记的mi R-322和阴性对照。收集细胞裂解液,通过RNA pull down验证miR-322与NOX4的结合。1.3将构建的NOX4萤光素酶报告基因质粒与miR-322 mimic或阴性对照共转染C17.2细胞,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-322与NOX4的相互作用。之后在细胞内进一步明确miR-322与NOX4的负向调控关系。1.4在C17.2细胞中干扰NOX4的表达,通过western blot检测相关凋亡指标的变化情况;在C17.2细胞中过表达NOX4,同时再转染miR-322 mimic,通过western blot检测相关凋亡指标的变化情况,并通过TUNEL实验检测细胞凋亡水平。1.5在体外胚胎培养中,向NTDs组的胚胎羊膜腔内注射miR-322模拟物。通过观察组织形态、western blot检测NOX4和凋亡相关指标的表达、TUNEL检测细胞凋亡水平,从而评估miR-322对减少细胞凋亡及治疗NTDs的效果。2、PCSK9在大鼠NTDs中的表达情况及抑制PCSK9增加NTDs发生风险的机制探究2.1使用ATRA建立大鼠NTDs模型,分别于胚胎发育的E11-E20取脊髓组织。2.2分别采用qRT-PCR、Western Blot检测PCSK9在大鼠胚胎发育过程中E11-E20的表达情况。2.3采用血药浓度测定和Western Blot评价PCSK9抑制剂SBC115076效果。2.4探究PCSK9抑制剂SBC115076与ATRA联合使用,是否能导致NTDs发生率增加,或是否能增加胎鼠对ATRA的致畸敏感性。2.5使用PCSK9敲除小鼠进一步验证PCSK9是否增加胎鼠对ATRA的致畸敏感性。2.6使用Western Blot验证抑制PCSK9后,C17.2神经干细胞和胚胎脊髓组织中caspase3、Bcl2、Bax的表达变化,探究PCSK9与凋亡的关系。2.7使用脂质组学技术分析孕鼠血清样本和胚胎脊髓组织样本中的脂质成分及表达量。结果:1.miR-322通过沉默NOX4参与NTDs的形成1.1在ATRA构建的NTDs小鼠模型中,mi R-322表达下调。相反,NOX4的蛋白表达水平发生了明显上调,但mRNA水平并没有明显改变。1.2 NOX4是miR-322的潜在靶基因,且二者之间的相互作用是通过存在于NOX4 mRNA的3’端非翻译区上的结合位点实现的。当过表达miR-322时,NOX4的蛋白表达水平相应地降低,但mRNA水平没有明显改变;当抑制miR-322时,NOX4的蛋白表达水平明显升高,mRNA水平同样无明显变化。1.2在C17.2细胞中,干扰NOX4的表达,促凋亡蛋白caspase3和Bax的表达水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加;而过表达NOX4后,促凋亡蛋白caspase3和Bax的表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少,且细胞凋亡水平增加;在此基础上,同时转染miR-322 mimic,可以挽回NOX4过表达导致的凋亡相关蛋白的改变,同时减少细胞凋亡。1.3向胚胎羊膜腔内注射miR-322 mimic治疗后,检测到胚胎中NOX4的蛋白表达明显降低。与此同时,Bcl-2表达水平升高,caspase3和Bax的表达发生下调,细胞凋亡减少。2、PCSK9在大鼠NTDs中的表达情况及抑制PCSK9增加NTDs发生风险的机制探究2.1在胚胎发育的E11-E20,与对照组相比,NTDs组PCSK9的mRNA和蛋白水平发生明显下调。2.2 SBC115076可抑制大鼠体内PCSK9的表达。SBC115076与ATRA联用可以增加胚胎的畸形率。在PCSK9-/-小鼠中也得到一致结论。2.3抑制PCSK9可增加C17.2神经干细胞和胚胎脊髓组织中促凋亡蛋白caspase3、Bax的表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论:1.NOX4是mi R-322的新靶点,并通过位于NOX4 mRNA 3’端非翻译区的结合位点与miR-322相互作用2.低表达的miR-322可增加NOX4蛋白表达水平引起细胞凋亡,参与NTDs发生。3.miR-322对NTDs胚胎细胞凋亡的治疗作用,可成为治疗NTDs的新靶点。4.PCSK9在NTDs脊髓组织发育过程中持续低表达。5.抑制PCSK9能够增加胚胎对ATRA的致畸敏感性。6.抑制PCSK9可通过上调Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl-2促进细胞凋亡,从而参与NTDs发生。
姜明宇,张剑白,任明永,刘海春[8]（2020）在《胚胎期宫内移植骨髓间充质干细胞对显性脊柱裂胎鼠脊髓骨形态发生蛋白4表达水平的影响研究》文中指出背景骨形态发生蛋白4（BMP4）在神经管背腹轴模式的形成、细胞凋亡以及干细胞的分化和转化过程中均起重要作用,通过转基因的方法将BMP4基因转入骨髓间充质干细胞（MSCs）后,是否能分泌一定水平的BMP4,使干细胞既能替代受损神经元,又具有重建侧支循环和神经保护作用,一直是未解决的热点问题。目的观察MSCs移植前后,显性脊柱裂胎鼠脊髓组织中BMP4表达情况。方法于2017年11月—2018年10月,在哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心购买Wistar实验大鼠50只（雄鼠8只,雌鼠42只）,出生后10 d的Wistar大鼠5只留作干细胞来源。常规条件下饲养,午夜合笼,确认交配。利用致畸药物维甲酸建立显性脊柱裂胎鼠模型,利用显微外科注射技术对胎鼠进行MSCs移植治疗。将同一只孕鼠所孕的胎鼠分为维甲酸无畸形组（10只）、脊柱裂畸形组（12只）、维甲酸无畸形干细胞移植组（10只）、畸形干细胞移植组（10只）和畸形空白移植组（8只）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）法检测各组BMP4和拮抗剂Noggin mRNA表达情况。结果脊柱裂畸形组BMP4 mRNA表达水平高于维甲酸无畸形组,Noggin mRNA表达水平低于维甲酸无畸形组（P<0.05）。脊柱裂畸形组、畸形干细胞移植组和畸形空白移植组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较,差异有统计学意义（P<0.05）;其中畸形干细胞移植组BMP4 mRNA表达水平高于脊柱裂畸形组和畸形空白移植组,Noggin mRNA表达水平低于脊柱裂畸形组和畸形空白移植组（P<0.05）。维甲酸无畸形组和维甲酸无畸形干细胞移植组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 BMP4与先天性显性脊柱裂畸形的发病机制有关;在MSCs移植治疗先天性脊柱裂畸形过程中可能通过上调BMP4 mRNA的表达而最终达到治疗的目的。
胡晓芳,余永莉,陈涛,张彬渝,刘茂生,苏丽莉[9]（2018）在《桉叶油含药血清联合维甲酸对体外培养神经干细胞Pax3及Cx43的影响》文中研究表明目的探讨桉叶油联合维甲酸（RA）对神经干细胞Pax3、Cx43蛋白及基因表达水平的影响。方法原代培养神经干细胞并进行鉴定,收集传代后第二代的神经干细胞,分别加入5%鼠血清（自由饮食SD大鼠血清,溶剂花生油灌胃鼠血清,桉叶油1 500、1 000、300 mg/kg灌胃鼠血清）,5%鼠血清联合RA（5μmol/L）（自由饮食SD大鼠血清+RA,溶剂花生油灌胃鼠血清+RA,桉叶油1 500、1 000、300 mg/kg灌胃血清+RA）和RA（5μmol/L）培养48 h,收集细胞,提取蛋白,采用蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测细胞Pax3、Cx43蛋白表达水平;提取RNA,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞Pax3、Cx43基因表达水平。结果 （1）用5%鼠血清作用于细胞后,与正常血清组比较,桉叶油含药血清各组的Cx43蛋白及mRNA表达水平均较高（P<0.05）,Pax3蛋白及mRNA表达水平均较低（P<0.05）,提示桉叶油含药血清具有上调细胞的Cx43蛋白及其mRNA表达,下调细胞Pax3蛋白和mRNA表达的作用。（2）用5%鼠血清联合RA作用于细胞后,与单纯RA组比较,血清各组Pax3蛋白及mRNA表达水平均降低（P<0.05）;桉叶油含药血清各组的Pax3蛋白及mRNA表达水平均较正常血清组显着降低（P<0.05）。（3）与单纯RA组比较,血清各组Cx43蛋白及mRNA表达水平均降低;但桉叶油含药血清各组的Cx43蛋白及mRNA表达水平与正常血清组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 （1）桉叶油含药血清具有上调细胞的Cx43蛋白及其mRNA表达,下调细胞Pax3蛋白和mRNA表达的作用。（2）桉叶油含药血清具有拮抗RA上调细胞的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA表达的作用。
徐加明[10]（2018）在《Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用》文中研究说明研究背景神经管缺陷（neural tube defects,NTDs）是一种严重的神经系统的先天性缺陷,由于胚胎时期神经管发育过程中闭合异常引起,主要表现各种脑畸形。神经上皮细胞即神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是神经管闭合的关键细胞,覆盖在神经管表面,其增殖、分化及迁移是神经管正常闭合的关键,其异常的增值分化会导致神经管缺陷,它具有自我更新能力及分化成多种细胞的能力,可分化为各种神经细胞。在各种调节通路中,Notch信号通路对细胞的增殖分化及胚胎发育起着精密而复杂的调控作用,Notchl是Notch蛋白家族中的重要分子,在中枢神经系统的发育中起着关键作用,Notchl信号通路依靠γ内分泌酶的作用被激活。全反式维甲酸（All-trans Retinoic Acid,ATRA）在体内是维A酸的正常代谢产物,是胚胎发育的重要因素,而研究发现过量全反式维甲酸导致NTDs的发生,但其具体的分子机制未研究清楚。本研究,从细胞学水平研究Notchl在全反式维甲酸处理过的NSCs中的作用,探讨Notchl对NSCs增殖分化的调节作用,揭示全反式维甲酸导致神经管缺陷的分子机制,从而为神经干细胞的应用及临床预防神经管缺陷提供新的方向。目的通过利用ATRA处理神经干细胞,检测神经干细胞分化产生的细胞标记物及Notchl的表达,研究Notchl及ATRA与神经干细胞分化的作用,探究Notchl在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用,从而揭示其对神经管发育的影响。方法1.原代神经干细胞的提取将C57/BL6小鼠按照雌雄2:1的比例（雌鼠2只,雄鼠1只）合笼,第二天早8点检查雌鼠有无阴栓,见栓后记为孕0.5天,取孕18.5胎鼠的大脑提取原代神经干细胞。2.免疫荧光用含有10%的胎牛血清的分化培养基对神经干细胞进行诱导分化,然后免疫荧光鉴定神经干细胞及分化产生的神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞,并检测Notch1在上述细胞的中的分布。3.Western blotting3.1 Western blotting检测神经干细胞中Notch1,神经干细胞标记物-巢蛋白（Nestin）、神经元标记物-神经丝蛋白（NF）、星型胶质细胞标记物-神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及少突胶质细胞标记物-半乳糖脑苷脂（GALC）分别在普通分化培养基（对照组）和1 μ mol/LATRA（实验组）中1,3,5,7天时的含量。3.2将神经干细胞分为四组:A组:普通分化培养基,B组:普通分化培养基+DMSO组,C组:普通分化培养基+DMSO+25μMol γ-内分泌酶抑制剂,D组:普通分化培养基+DMSO+50μMol γ-内分泌酶抑制剂,然后用Western blotting技术分别检测各组Notch1含量。结果1.原代神经干细胞分化培养1天时,可见多个神经球形成。分化3天时,神经球形态开始发生改变,部分神经干细胞从神经球中游离出来。分化5天时,神经球明显减小,伸出条索状突起。分化7天时,可见多种不同形态的神经细胞,一种是胞体成圆形或椭圆形,伸出一条细长突起的神经元样细胞,一种是胞体成多角型并伸出多条较粗的突起,可见明显胞核的星型胶质样细胞,一种是胞体较小,伸出短小突起的少突胶质样细胞。2.免疫荧光鉴定分化培养基中神经干细胞中Nestin、NF、GFAP及GALC成阳性,且在神经干细胞、神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞胞膜上及细胞质中有Notch1存在。3.ATRA处理神经干细胞前后Notch1及NF、GFAP、GALC的含量变化从1天到5天,对照组的神经干细胞中Notch1,第5天相对第1天有明显的增加（P＜0.05）,从第5天到第7天,Notch1明显下降（P＜0.05）,NF在第3天相对第1天有明显增加（P＜0.05）,第5相对第3天有明显下降（P＜0.05）,GFAP与GALC含量在1,3天无明显变化,GFAP第5天明显相对第1天明显下降（P＜0.05）,而第7天含量相比第5天明显增加（P＜0.05）。GALC第5天明显相对第1天明显下降,而第7天含量相比第5天明显增加（P＜0.05）。实验组的神经干细胞,1天到3天时,Notch1未见明显变化,第7天Notch1含量较第1天明显下降（P＜0.05）,而NF第7天含量相比第1天明显增加（P＜0.05）,第5天与第1天相比明显增加（P＜0.05）,GFAP第7天含量相比第1天明显增加（P＜0.05）,第5天与第1天相比明显增加（P＜0.05）,GALC第7天含量相比第1天明显增加（P＜0.05）,第5天与第1天相比明显增加（P＜0.05）。4.γ内分泌酶抑制剂处理神经干细胞后Notch1含量变化C组的神经干细胞Notch1的胞内段（分子量120KD）表达量较A组明显降低（P＜0.05）,D组的神经干细胞Notch1的胞内段（分子量120KD）表达量较A组明显降低（P＜0.05）,C组的神经干细胞Notch1的全长（分子量300KD）表达量较A组明显增加（P＜0.05）,D组的神经干细胞Notch1的胞内段（分子量300KD）表达量较A组明显（P＜0.05）。结论1.Notch1抑制神经干细胞分化。2.ATRA处理神经干细胞后,Notch1含量下降,神经干细胞分化增强,ATRA促进神经干细胞的分化。3.γ内分泌酶抑制剂作用于神经干细胞,NICD含量减少,抑制神经干细胞分化的能力下降。我们推测ATRA主要通过抑制γ内分泌酶的作用而抑制Notch1信号通路,从而促进神经干细胞的分化。为我们对神经干细胞在将来的临床应用提供了理论基础并且给我们预防胎儿神经管缺陷提供了新的治疗窗口。
二、维甲酸诱导神经管畸形发生过程中神经干细胞的变化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、维甲酸诱导神经管畸形发生过程中神经干细胞的变化研究（论文提纲范文）
（1）叶酸缺乏致神经管畸形易感基因双链断裂的表观特征及新易感基因筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 临床标本 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器及器械 |
| 2.4 试剂配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 MTX诱导mESCs发生DSB富集于基因的启动子和增强子区 |
| 3.2 MTX诱导基因组启动子区发生的DSB影响基因转录 |
| 3.3 基因组活性启动子区发生的DSB伴随着表观修饰共同影响基因转录 |
| 3.4 MTX诱导基因组活性增强子区发生的DSB影响启动子活性 |
| 3.5 MTX诱导基因组发生DSB后通过CTCF介导的TAD改变影响NTDs易感基因的转录 |
| 3.6 DSB诱导的NTDs新易感基因的筛选及验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 叶酸缺乏诱导基因组调控元件发生DSB后会导致基因表达改变 |
| 4.2 叶酸缺乏诱导基因组发生DSB与NTDs发生相关 |
| 5 结论 |
| 5.1 MTX诱导基因组启动子区发生DSB后导致基因组该区域染色质结构的改变进而影响NTDs易感基因基因表达 |
| 5.2 MTX诱导的基因组远端增强子区发生DSB后影响与启动子之间的互作导致NTDs易感基因表达紊乱 |
| 5.3 PABPC4、MED13L、TPGS1、FAM208A、SF3B5、BYMC、FAM109A是NTDs的新易感基因 |
| 参考文献一 |
| 综述 常见信号通路与神经管畸形的发生 |
| 参考文献二 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）基于PI3K/Akt信号通路研究五子衍宗丸防控神经管畸形的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 五子衍宗丸中叶酸含量的测定 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验药物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 仪器条件 |
| 2.2 样品的制备 |
| 2.3 测定方法 |
| 2.4 标准曲线与线性范围 |
| 2.5 质量控制 |
| 2.6 数据处理方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 LC-MS质谱图 |
| 3.2 标准曲线与线性范围 |
| 4.结论 |
| 第二章 五子衍宗丸对神经管畸形小鼠氧化应激和细胞凋亡的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 药物制备 |
| 2.3 造模及给药 |
| 2.4 样品采集与制备 |
| 2.5 指标检测 |
| 2.6 实验试剂配制 |
| 2.7 数据处理方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 NTDs小鼠畸形率统计 |
| 3.2 NTDs小鼠形态学观察 |
| 3.3 HE染色观察神经管闭合情况 |
| 3.4 TUNEL染色检测细胞凋亡 |
| 3.5 WYP对 NTDs小鼠PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 3.6 WYP对 NTDs小鼠GSH、SOD、GSH-Px、CAT表达的影响 |
| 3.7 WYP对 NTDs小鼠Bax、Bcl-2 表达的影响 |
| 4.结论 |
| 第三章 五子衍宗丸对CHO细胞和CHO/DHFR-细胞氧化应激和细胞凋亡的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验药物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 药物制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 造模及给药 |
| 2.5 样品采集与制备 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 数据处理方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 WYP对 CHO细胞和CHO/dhFr-细胞OS的影响 |
| 3.2 WYP对 CHO细胞和CHO/dhFr-细胞凋亡途径的影响 |
| 4.结论 |
| 讨论 |
| 1.WYP 中未检测出FA,可以排除WYP 中固有FA的干扰 |
| 2.WYP对 atRA诱导的NTDs小鼠具有良好的预防效果 |
| 3.WYP调控NTDs小鼠PI3K/Akt信号通路 |
| 4.WYP改善NTDs小鼠体内OS状态 |
| 5.WYP抑制NTDs小鼠的凋亡途径 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 神经管畸形的发病机制和叶酸的干预机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）Notchl对全反式维甲酸诱导的神经管缺陷和神经干细胞分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ENGLISH ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 中文部分 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠神经管缺陷模型的建立及Notchl在atRA诱导的神经管缺陷中的作用机制 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 Notchl对atRA诱导的神经干细胞分化中的作用 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附表附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
| ABSTRACT |
| Introduction |
| Part Ⅰ The establishment of neural tube defect model in mice and the mechanism of Notchl in atRA-induced neural tube defects |
| Introduction |
| Object and Method |
| Results |
| Discussion |
| Conclusion |
| Part Ⅱ: The role of Notchl in the differentiation of NSCs induced by at-RA |
| Introduction |
| Object and Method |
| Results |
| Discussion |
| Conclusion |
| CONCLUSION |
| Attached Tables and Figures |
| REFERENCE |
| Acknowledgement |
| Research Papers Published |
（4）神经干细胞源外泌体促神经元分化作用与机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:利用lable free质谱筛选神经干细胞源外泌体中具有促神经元分化作用的蛋白质 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 分析软件 |
| 2.1.6 主要实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞原代提取与扩增 |
| 2.2.2 大鼠神经干细胞原代提取 |
| 2.2.3 大鼠神经干细胞的鉴定 |
| 2.2.4 神经干细胞源外泌体的提取 |
| 2.2.5 神经干细胞源外泌体的鉴定 |
| 2.2.6 Lable free质谱检测 |
| 2.2.7 Western Blot鉴定筛选的蛋白 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs与NSCs原代细胞提取及NSCs鉴定 |
| 3.2 神经干性源外泌体鉴定 |
| 3.3 SDS-PAGE凝胶电泳条带差异 |
| 3.4 差异蛋白及定量分析 |
| 3.5 GO注释与GO富集分析 |
| 3.5.1 全GO注释分析 |
| 3.5.2 差异蛋白GO注释与GO富集分析 |
| 3.5.3 神经干细胞源外泌体中促神经元分化蛋白筛选 |
| 3.6 聚类分析 |
| 3.7 Western Blot验证差异蛋白 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Netrin1上调Hand2/Phox2b促进神经干细胞向神经元分化 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要实验动物及实验细胞 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 神经干细胞的提取与培养 |
| 2.2.2 Netrin1作用神经干细胞 |
| 2.2.3 Netrin1下游靶蛋白筛选 |
| 2.2.4 验证Hand2/Phox2b在Netrin1 促神经元分化中的作用 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Netrin1促进大鼠神经干细胞的神经元分化 |
| 3.2 Netrin1促进小鼠神经干细胞的神经元分化 |
| 3.3 Netrin1处理细胞差异分析 |
| 3.4 Netrin1处理组中转录上调的基因的GO注释 |
| 3.5 聚类分析 |
| 3.6 PPI蛋白互作分析 |
| 3.7 Netrin1 促神经元分化作用依赖于Hand2/Phox2b |
| 3.7.1 Netrin1促进神经干细胞中Hand2和Phox2b蛋白表达 |
| 3.7.2 RNAi阻断Phox2b表达,检测 500ng/ml Netrin1处理后神经元标志物的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:神经干细胞源外泌体促进骨髓间充质干细胞向神经元分化 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠BMSCs原代提取与扩增 |
| 2.2.2 大鼠神经干细胞原代提取与鉴定 |
| 2.2.3 神经干细胞源外泌体的提取 |
| 2.2.4 神经干细胞源外泌体体外处理BMSCs并检测神经元标志物表达 |
| 2.2.5 500ng/ml Netrin1体外处理BMSCs并检测神经元标志物及Hand2、Phox2b的表达 |
| 2.2.6 利用全胚胎培养进行羊膜腔内联合移植神经干细胞源外泌体与BMSCs并检测神经元标志物表达 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经干细胞源外泌体促进BMSCs向神经元分化 |
| 3.2 Netrin1通过上调Hand2/Phox2b促进BMSCs向神经元分化 |
| 3.3 神经干细胞源外泌体促进大鼠神经管畸形胚胎细胞治疗的BMSCs向神经元分化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）MiRNA-10a-5p靶向CHL1调控神经干细胞生物学行为及在神经管畸形发生中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 NTDs模型的构建和小RNA组测序 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RA诱导的NTDs鼠胚模型的构建 |
| 2.2 sRNA测序数据质量控制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 NTDs鼠胚中miRNA表达谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 sRNA测序数据基本分析 |
| 2.2 RA诱导的NTDs鼠胚miRNA表达谱的改变 |
| 2.3 sRNA-seq测序数据中部分差异表达miRNAs的 RT-qPCR验证 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 miR-10a-5p异常表达对神经细胞生物学功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RA诱导的NTDs鼠胚组织中miR-10a-5p表达显着升高 |
| 2.2 NSCs的体外培养及鉴定 |
| 2.3 转染慢病毒或miRNA模拟物能有效改变细胞内miR-10a-5p的表达水平 |
| 2.4 miR-10a-5p过表达抑制了细胞的增殖能力 |
| 2.5 miR-10a-5p过表达延迟了细胞周期 |
| 2.6 miR-10a-5p过表达促进了细胞凋亡 |
| 2.7 miR-10a-5p过表达干扰了神经干细胞的分化能力 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学预测和筛选miR-10a-5p的靶基因 |
| 2.2 双荧光素酶报告实验验证Chl1为miR-10a-5p的靶基因 |
| 2.3 RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1 表达下调 |
| 2.4 NSCs中 miR-10a-5p过表达抑制靶基因Chl1 的表达 |
| 2.5 CHL1 敲低对NSCs细胞生物学功能的影响 |
| 2.6 CHL1 介导了miR-10a-5p对 NSCs增殖和分化能力的调节 |
| 2.7 NSCs中 CHL1 敲低抑制下游MAPK通路的表达 |
| 2.8 miR-10a-5p通过MAPK通路调节NSCs的增殖和分化能力 |
| 2.9 RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1 下游MAPK通路表达下调 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA在神经管畸形中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）miR-222-3p靶向Ddit4调控小鼠神经管闭合机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分mi R2223p在神经管畸形脑组织中表达的测序结果及其靶标验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 利用全反式维甲酸建立C57BL/6 鼠胚NTDs模型 |
| 1.6 通过Real-time PCR验证鼠胚脑组织中mi R2223p、Ddit4 m RNA水平的表达情况 |
| 1.7 HT-22 细胞培养及mi R2223p细胞转染 |
| 1.8 双荧光素酶报告基因技术检测mi R2223p靶标 |
| 1.9 转染效率验证 |
| 1.10 mi R2223p转染后Ddit4表达变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C57BL/6 鼠胚NTDs模型建立 |
| 2.2 mi R2223p、Ddit4在鼠胚脑组织中m RNA水平的表达情况 |
| 2.3 HT-22 细胞形态学观察 |
| 2.4 双荧光素酶报告基因技术 |
| 2.5 mi R2223p转染细胞水平验证 |
| 2.6 mi R2223p转染后对Ddit4 m RNA、蛋白水平的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分mi R2223p低表达对HT-22 细胞功能影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验器材 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 HT-22 细胞培养与转染 |
| 1.5 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 1.6 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 1.7 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞周期的影响 |
| 1.8 检测mi R2223p低表达对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 mi R2223p低表达对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 2.2 mi R2223p低表达对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 mi R2223p低表达对HT-22 细胞周期的影响 |
| 2.4 mi R2223p低表达对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 探索mi R2223p低表达对HT-22 细胞机制的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验器材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 细胞培养与转染 |
| 1.5 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 1.6 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 1.7 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞周期的影响 |
| 1.8 检测Anti-222、Ddit4干扰对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 1.9 Real-tine PCR检测 β-catenin、TCF4 m RNA水平的表达变化 |
| 1.10 Western blotting检测 β-catenin、TCF、cmyc、cycin D1蛋白水平的表达变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞增殖的影响 |
| 2.2 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞周期的影响 |
| 2.4 Anti-222+si R-Ddit4对HT-22 细胞迁移的影响 |
| 2.5 Anti-222+si R-Ddit4对 β-catenin、TCF4 m RNA水平的表达变化 |
| 2.6 Anti-222+si R-Ddit4对 β-catenin、TCF、C-myc、Cycin-D1蛋白水平的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）神经管畸形动物模型中凋亡调控因子（miR-322、PCSK9）的表达规律及作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :miR-322 通过沉默NOX4 减少细胞凋亡治疗神经管畸形 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠NTDs模型制备及组织样本收集 |
| 2.2.2 体外全胚胎培养 |
| 2.2.3 细胞复苏、培养和传代 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 RNA pull down实验 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.7 TUNEL实验 |
| 2.2.8 细胞、组织中总RNA和 microRNA提取 |
| 2.2.9 RNA定量、逆转录及实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 蛋白质提取、定量及Western Blot实验 |
| 2.2.11 组织切片制备、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、免疫组化和免疫荧光染色 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在ATRA诱导NTDs模型中mi R-322和NOX4 表达改变 |
| 3.2 NOX4是miR-322 新的靶基因且可以与miR-322 相互作用 |
| 3.3 miR-322 抑制NOX4 的翻译 |
| 3.4 miR-322 减少NOX4 诱导产生的细胞凋亡 |
| 3.5 体外miR-322 治疗可减少NTDs胚胎中的细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :PCSK9 在大鼠NTDs中的表达规律及抑制PCSK9 增加NTDs发生风险的机制探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠NTDs模型制备及组织样本收集 |
| 2.2.2 细胞复苏、培养和传代 |
| 2.2.3 组织总RNA提取 |
| 2.2.4 RNA定量、逆转录及实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 蛋白质提取、定量及Western Blot实验 |
| 2.2.6 SBC115076与ATRA联用对大鼠NTDs发生率的影响实验 |
| 2.2.7 PCSK9~(-/-)鼠与ATRA联用对 NTDs 发生率的影响实验 |
| 2.2.8 血药浓度测定 |
| 2.2.9 脂质组学分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PCSK9在NTDs大鼠胚胎发育过程中低表达 |
| 3.2 抑制PCSK9 表达可增加大鼠胚胎对ATRA的致畸敏感性 |
| 3.3 抑制PCSK9 可增加神经干细胞和NTDs胚胎组织的细胞凋亡 |
| 3.4 孕鼠血清及胎鼠脊髓组织脂质代谢分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）胚胎期宫内移植骨髓间充质干细胞对显性脊柱裂胎鼠脊髓骨形态发生蛋白4表达水平的影响研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1显性脊柱裂畸形胎鼠模型的构建 |
| 1.2干细胞原代培养及腺病毒-GFP转染 |
| 1.3 MSCs移植治疗 |
| 1.4利用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）方法检测各组脊髓组织中BMP4和拮抗剂Noggin m RNA表达情况 |
| 1.5统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 移植前后孕鼠和胎鼠的存活结果 |
| 2.2 移植后存活的MSCs在胎鼠脊髓组织内的迁移和分布情况 |
| 2.3 利用Real-time PCR方法检测各组脊髓组织中BMP4、Noggin mRNA表达情况 |
| 2.3.1 维甲酸无畸形组和脊柱裂畸形组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较 |
| 2.3.2脊柱裂畸形组、畸形干细胞移植组和畸形空白移植组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3维甲酸无畸形组和维甲酸无畸形干细胞移植组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较 |
| 3 讨论 |
（9）桉叶油含药血清联合维甲酸对体外培养神经干细胞Pax3及Cx43的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药品及试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 桉叶油含药血清的制备 |
| 1.2.2 神经干细胞培养及鉴定 |
| 1.2.3 桉叶油含药血清对体外培养胎鼠神经干细胞Pax3、Cx43表达的影响 |
| 1.2.4桉叶油含药血清联合RA对体外培养胎鼠神经干细胞、表达的影响 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠神经干细胞的培养及鉴定 |
| 2.2 桉叶油含药血清对体外培养胎鼠神经干细胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表达的影响 |
| 2.3 桉叶油含药血清联合维甲酸对体外培养胎鼠神经干细胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
（10）Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、维甲酸诱导神经管畸形发生过程中神经干细胞的变化研究（论文参考文献）
- [1]叶酸缺乏致神经管畸形易感基因双链断裂的表观特征及新易感基因筛选[D]. 李建婷. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]基于PI3K/Akt信号通路研究五子衍宗丸防控神经管畸形的机制[D]. 杨婵娟. 山西中医药大学, 2021
- [3]Notchl对全反式维甲酸诱导的神经管缺陷和神经干细胞分化的影响[D]. 陈娜. 山东大学, 2021(12)
- [4]神经干细胞源外泌体促神经元分化作用与机制的实验研究[D]. 马玲. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]MiRNA-10a-5p靶向CHL1调控神经干细胞生物学行为及在神经管畸形发生中的作用机制研究[D]. 张娟. 山西医科大学, 2020(01)
- [6]miR-222-3p靶向Ddit4调控小鼠神经管闭合机制的初步研究[D]. 孙雨晴. 山西医科大学, 2020(11)
- [7]神经管畸形动物模型中凋亡调控因子（miR-322、PCSK9）的表达规律及作用机制的研究[D]. 刘玉思. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]胚胎期宫内移植骨髓间充质干细胞对显性脊柱裂胎鼠脊髓骨形态发生蛋白4表达水平的影响研究[J]. 姜明宇,张剑白,任明永,刘海春. 中国全科医学, 2020(02)
- [9]桉叶油含药血清联合维甲酸对体外培养神经干细胞Pax3及Cx43的影响[J]. 胡晓芳,余永莉,陈涛,张彬渝,刘茂生,苏丽莉. 现代医药卫生, 2018(21)
- [10]Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用[D]. 徐加明. 山东大学, 2018(01)