一、用肽ELISA区分抗FMD接种动物和康复动物（论文文献综述）
鲁海冰[1]（2017）在《双抗体夹心ELISA检测羊肠道病毒抗原方法的建立与应用及病毒VP1蛋白抗原表位的筛选》文中提出肠道病毒为小RNA病毒科肠道病毒属成员。根据最新的病毒分类,肠道病毒属包含9个肠道病毒种（A,B,C,D,E,F,G,H,J）和3个鼻病毒种（A,B,C）,它们是引起人类和动物临床上以神经系统、呼吸系统和消化系统疫病的重要病原体。其中E和F种肠道病毒主要感染牛,G种肠道病毒主要感染猪,给畜牧业造成严重经济损失。羊肠道病毒感染为国内外新发传染病,有关该病的诊断、防治及病毒致病机理等方面缺乏研究。本实验室在国内首次从腹泻山羊体内分离到一株2030 nm的肠道病毒,命名为CEV-JL14。为了建立一种特异、敏感、快速与简便检测羊肠道病毒的诊断方法,以便为本病的流行病学研究提供技术手段,本研究应用RT-PCR扩增出CEV-JL14病毒的VP1基因序列,并将其克隆到原核表达载体,构建表达GST-VP1重组蛋白的原核表达质粒。以纯化表达的CEV的结构蛋白VP1,制备了针对VP1的单克隆抗体和兔源多克隆抗体,并以此建立了检测CEV抗原的双抗体夹心ELISA方法和研制检测CEV抗原的试剂盒。特异性、敏感性、重复性和稳定性试验结果显示,建立的检测CEV抗原的双抗体夹心ELISA方法及其试剂盒具有特异、敏感、快速、简便与稳定等特点。试剂盒4℃条件下可保存180 d。应用建立的夹心ELISA方法对吉林省和内蒙古部分地区的777份羊粪进行检测,结果发现上述地区的羊群存在程度不同的肠道病毒感,羊群CEV的感染率为11.4%100.0%。利用肽扫描技术对制备的单克隆抗体6A1进行了抗原表位的筛选,确定羊肠道病毒单克隆抗体6A1的特异性表位为152TPPTDQDTYQWQT164。该结果为进一步研究CEV所诱导的免疫应答及病毒致病机理打下基础。综上所述,本研究制备了抗羊肠道病毒VP1的单克隆抗体和多克隆抗体,建立了特异敏感的检测CEV抗原的双抗体夹心ELISA方法和研发检测羊肠道病毒抗原的试剂盒,发现吉林省和内蒙古部分地区存在程度不同的的羊肠道病毒感染。同时确定羊肠道病毒单克隆抗体6A1的特异性表位。本研究结果为今后羊肠道病毒感染的诊断、检疫及防制提供了有效的手段和流行病学理论依据。
刘华南[2]（2015）在《口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体制备、抗原位点鉴定及竞争ELISA方法的初步建立》文中研究表明为了获得Asia-1口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以Asia-1型FMDV JS/05毒株RNA为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a载体,进行原核表达及纯化。以Asia-1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4-6周龄的Balb/c雌鼠,经过4次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按5:1进行融合,用间接ELISA方法对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释,阳性细胞扩大培养后腹腔注射小鼠,制备腹水,并对制取的腹水进行亚型鉴定,反应原性和效价鉴定。将3B蛋白拆分,并构建pGEX-4T1载体,融合GST标签表达,通过间接ELISA验证3B抗体的反应特性,并通过口蹄疫3ABC检测试剂盒筛选临床阳性和阴性血清,利用本实验获得的3B抗体建立竞争ELISA方法,用于检测临床样品中口蹄疫3B蛋白的抗体。结果表明,获得一株稳定分泌抗口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体亚类为IgM,腹水效价为1:12800,通过Western boltting和间接免疫荧光实验鉴定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。SDS-PAGE结果表明,成功表达和纯化3B截短融合GST标签的重组蛋白,间接ELISA结果表明,本实验获得的抗体和3B1蛋白特异性反应。通过口蹄疫3ABC检测试剂盒,筛选出临床4份阳性血清,和4份阴性血清,利用本实验获得的3B抗体建立竞争ELISA方法,检测口蹄疫3B抗体,结果显示4份阳性血清显示出不同程度的抑制率,且具有剂量依赖性,4份阴性血清无抑制作用,无剂量依赖性,表明此竞争ELISA方法和3ABC检测方法符合率100%。
郑威[3]（2014）在《口蹄疫病毒非结构蛋白2C影响宿主先天性免疫的机理》文中研究表明口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是国际兽疫局（OIE）动物传染性疾病名录上排名第一位的,影响动物及动物产品国际贸易最重要的疾病。FMD病原是口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV）,主要的感染对象为偶蹄类动物,并且传染性非常高。只要发生FMD疫情,必将造成恶劣的社会影响和惨痛的经济损失。FMDV能够在被感染的动物内迅速复制,其主要通过接触易感动物和气溶胶传播。FMDV是单股正链RNA病毒,确认了七个血清型：A, O, C, Asia-1, SAT1, SAT2,和SAT3型,每个血清型还有很多亚型,各血清型之间没有交叉保护力,动物感染一型FMD后,仍然无法影响另外一型FMDV的入侵而病发,所以防控难度特别大。FMDV2C,是由318个氨基酸组成非结构蛋白,是病毒RNA复制复合体最大的膜结合蛋白。2C主要定位于胞浆,具有多个独立的功能性结构域,可以发挥多种不同功能。FMDV2C能够非特异性结合ssRNA并具有ATPase活性,而且能够在感染过程中与多个宿主细胞因子的相互作用。2C预测性研究显示,FMDV感染早期2C有能力结合细胞内细胞器膜,形成囊泡为病毒复制提供内环境,逃逸宿主先天性免疫应答。然而FMDV2C在病毒感染整个过程的功能,与宿主细胞相互作用的分子机制还有待进一步阐明。本实验室之前的工作,利用酵母双杂交技术,以FMDV的非结构蛋白2C为“诱饵”蛋白,以PK15细胞的cDNA文库为“猎物”,得到与FMDV2C相互作用的细胞靶蛋白。经过NCBI序列比对,发现与2C互作蛋白为N-Myc and STAT interactor （Nmi）蛋白。利用BHK-21,PK15和HEK293T细胞,利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、内源性Nmi pull-down方法和激光共聚焦显微镜,证明FMDV非结构蛋白2C和Nmi相互作用。FMDV非结构蛋白2C是一种膜结合蛋白,在细胞内成颗粒状分布,定位在内质网和线粒体等细胞器膜上。外源性过表达或者细胞内源性Nmi蛋白均是均匀分布在胞浆内,可是与FMDV非结构蛋白2C结合后,在电子显微镜下观察发现Nmi的分布发生改变,成颗粒状分布在胞浆内,或许这正展示出2C蛋白的功能特点,即引起细胞内膜系统重排,对FMDV RNA复制时形成复制复合体具有重要的意义。IFP35是IFP蛋白家族中的一员,分子量为35千道尔顿,与Nmi蛋白相互作用的细胞蛋白,可以抑制病毒基因的表达。过表达IFP35能够使Nmi蛋白由均匀分布在胞浆内改变为颗粒状分布。我们证明2C与IFP35不直接发生相互作用,而是2C与Nmi互作,Nmi招募IFP35。利用双荧光素酶报告基因系统实验、Real-time PCR和蚀斑实验（plaque formation assay）分别在上游启动子水平,中游mRNA水平和下游蛋白水平,我们得到一致结果：2C和Nmi诱导IFN-α/p和NF-κB的表达,IFP35为Nmi下游蛋白,2C和Nmi诱导IFN-α/p和NF-κB表达,是借助IFP35实现的。本次研究为今后深入探寻口蹄疫病毒非结构蛋白2C对宿主细胞的作用和分子机理,为更加深入了解FMDV与宿主细胞相互作用,以及FMDV造成宿主持续感染和免疫抑制机理提供具有重要价值的参考。
李继东[4]（2014）在《小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究》文中认为口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）、小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）和羊痘（capripox，CP）是危害山羊、绵羊等小型反刍动物的3种重大疫病，均为世界动物卫生组织（OIE）发布的A类烈性传染病。3种疫病的病原分别是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）、小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）和羊痘病毒（capripoxvirus，CPV）。目前这3类疫病的防控主要依靠灭活苗或弱毒苗，在实际应用中存在着免疫持续期短、热稳定性差、病毒毒力有返强风险等诸多缺陷。因此，需要研制更为安全高效的新型疫苗。病毒载体是现代生物科学研究的热点之一，诸多病毒载体已成功构建，并成为研制新型疫苗的候选工具。羊痘病毒活载体就是其中之一。在上述3种感染羊的病毒中，PPRV的H蛋白和F蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原；而FMDV的P1-2A在3C的作用下可以形成病毒的核衣壳，是中和抗体产生的主要诱导物，其中P1蛋白中的VP1片段是抗原决定簇最集中的区域，因此，PPRV的H和F基因、FMDV的VP1基因和P12A3C片段是研制亚单位疫苗和重组疫苗的主要候选基因。本研究利用DNA重组技术，构建用于羊痘病毒重组的基因工程转移载体，通过转移载体和病毒之间的同源重组，将PPRV和FMDV的抗原基因分别插入到羊痘病毒基因组中，形成重组羊痘病毒，作为转运外源蛋白的活载体，旨在研制一种能有效预防PPR、羊FMD、羊痘的高效疫苗。获得结果如下：1.构建了重组转移质粒ptkpp，并通过延长重组同源臂、插入报告基因GFP和压力筛选基因gpt、引入多克隆位点，优化了其功能，最后形成了可重复使用的转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi；验证了重组转移质粒启动子p7.5和p11的功能，为此系列质粒的正常使用奠定了基础。2.将PPRV和O型FMDV的抗原基因分别插入转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi的多克隆位点中，构建了6个重组质粒：pftkpgigp-H、pftkpgigp-F、pftkpgigp-VP1、pftkpgigp-P12A3C、pftkpgigp-H-i-P12A3C、pftkpgigp-F-i-P12A3C，以用于和羊痘病毒的同源重组。3.用脂质体转染法将6个重组转移质粒分别导入预先感染羊痘病毒的羔羊睾丸细胞中，经同源重组获得了6株重组羊痘病毒第一代混悬液。然后用选择培养液反复培养筛选纯化，通过GFP的表达、细胞病变效应以及PCR法检测，初步鉴定形成了4株重组GPV，分别命名为rGPV/FMDV-VP1（携带FMDV VP1基因）、rGPV/PPRV-F（携带PPRV F基因）、rGPV/PPRV-H（携带PPRV H基因）、rGPV/PPRVF-FMDVP12A3C（携带PPRV F基因和FMDV的P12A3C片段）。4.4株rGPV分别感染LT细胞，经RT-PCR检测mRNA的转录状况，后用间接免疫荧光技术检测外源基因的表达。结果显示，所有插入的外源基因得到了正常转录，其表达产物与特异性抗体之间产生了良好的免疫反应。5.4株rGPV按105TCID50剂量经皮内接种山羊，分别诱导产生了较高水平的抗GPV、FMDV和PPRV抗体；产生的抗GPV抗体效价和GPV疫苗差异不显着，抗FMDV抗体效价和疫苗组差异显着，抗PPRV效价在加强免疫后和疫苗组差异不显着。
张琳[5]（2013）在《鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定》文中研究说明抗原表位（Epitope）又称为抗原决定簇（antigenic determinant,AD），是抗原分子中被免疫系统，特别是抗体、B细胞、T细胞识别的部分。B细胞的BCR识别的表位为B细胞表位，T细胞的TCR识别的表位为T细胞表位。鉴定分析抗原表位对了解抗原物质的结构与功能，研制安全有效的表位疫苗以及研发基于表位诊断试剂具有重要意义。鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）引起的，以蛋鸭、种鸭产蛋骤然下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。2010年初，我国的江浙沪地区陆续爆发该病，蛋鸭产蛋严重下降，肉鸭生长迟缓，给我国养殖业造成了严重的经济损失。近两年对该病毒的一些分子生物学特已经进行了深入研究，但迄今为止，对于该病毒的抗原表位还没有报道。为深入了解病毒的抗原结构，便于设计科学合理的疫苗和诊断试剂，我们对DTMUV浙江分离株（YY5株）进行了抗原表位的鉴定。本研究RT-PCR扩增出鸭坦布苏病毒YY5株的E蛋白基因，插入pMBP-c表达载体进行原核表达，获得了具有良好生物活性的可溶性融合蛋白MBP-E。用纯化的重组蛋白MBP-E为抗原免疫Balb/C小鼠，经细胞融合，选择培养，成功筛选出两株抗鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ（domain Ⅲ，DⅢ）的单克隆抗体，分别命名为AE4和BD10。两株单克隆抗体间接免疫荧光试验（IFA）结果呈阳性，而仅有BD10能与MBP-E重组蛋白进行Western blot反应，可初步推断BD10识别E蛋白DⅢ区的一个B细胞线性表位。针对E蛋白的DⅢ区设计了一系列末端相互重叠的15个短肽，这些短肽与MBP进行融合表达，用BD10对15个短肽融合蛋白进行Western blot和ELISA鉴定，精确定位BD10识别的一个B细胞线性抗原表位。将纯化的表位融合蛋白MBP-EP385对小鼠进行免疫，获得的多克隆抗体能够识别DⅢ蛋白和MBP-E融合蛋白，表明表位EP385具有良好的免疫原性。结果表明，通过表达蛋白结合单抗法鉴定出一株鸭坦布苏病毒E蛋白的一个B细胞线性表位的核心区域EP385(385LVGSGKGQ393)。这对进一步分析鸭坦布苏病毒E蛋白的结构与功能以及建立以表位为基础的诊断方法和基于表位的疫苗设计具有重要的意义。
王欢[6]（2013）在《3A与3B表位串联抗原的口蹄疫鉴别诊断ELISA的研究》文中研究表明口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的以感染偶蹄兽为主的急性、热性、高度接触传染性疫病。该病的发生严重地限制易感动物的国际贸易，近几年我国局部口蹄疫疫情严重，给畜牧业带来较大的经济损失。因此，防控和监测口蹄疫疫情由为重要，如何快速鉴别自然感染与疫苗免疫动物是防控口蹄疫的重要部分。本研究对本实验室筛选鉴定出的1株Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A上的2个B细胞线性表位进行加工修饰成一条短肽，之后与非结构蛋白3B上的一段合成短肽进行反复串联，并在大肠杆菌中表达出5种不同的重组蛋白，表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析证明，这5种蛋白都可以与口蹄阳性血清反应，从中选出1个抗原性最强的目的蛋白做Western blot分析证实，此抗原可以与3种口蹄疫血清型牛阳性血清发生良好的特异性反应，并将其作为包被抗原，建立一种间接ELISA检测方法来对牛口蹄疫病毒非结构蛋白抗体进行检测来区别自然感染牛和疫苗免疫牛。使用本ELISA方法检测了184份已知阴性牛血清，以“阴性血清对照均值+3SD”作为临界值判定标准，即S/P>0.31为阳性，并设定了可疑区间：阴性血清对照均值+2SD〈可疑区间〈阴性血清对照均值+3SD即：0.23≤S/P≤0.31；S/P<0.23为阴性。用建立的方法检测40份已知口蹄疫阳性血清，检出率为100%，说明本方法的敏感性为100%；对常见的4种牛病阳性血清进行特异性交叉试验，检测结果表明该ELISA检测方法不4种阳性血清发生反应，具有较好的特异性，同时重复性试验的批内、批间变异系数均小于10%。通过比较发现本ELISA与Ceditest竞争ELISA试剂盒的符合率最高为96.25%；与兰兽研3ABC间接ELISA试剂盒次之，为93.48%；与世纪元亨阻断ELISA的符合率为84.35%，最低。利用本方法对不同地区的5个奶牛养殖场的829份血清样本进行检测，阳性率从8.02%到47.75%不等。r3AB-ELISA的建立可用于口蹄疫的鉴别诊断，为FMD的综合防控提供了技术支持和物质基础。本研究以血清学ELISA的（2BF2AF）2抗原作为检测抗原为基础建立了检测奶液的奶液间接ELISA方法，并确立了临界值标准：S/P≥0.2为阳性，S/P≤0.2为阴性。以兰兽研3ABC间接ELISA试剂盒检测血清为参考标准，用奶液ELISA检测对应奶液，符合率为86.36%，利用本奶液ELISA方法对不同地区的3个奶牛养殖场的522份奶液样本进行检测，阳性率在10%-16.58%之间；对混合奶液的监测作了初步的探索，可检测出16份阴性奶液中的1份弱阳性奶液样本，为牛口蹄疫疫情的群体监测提供了理论基础。
王文世[7]（2013）在《蓝舌病病毒16型VP2、VP5蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定》文中指出蓝舌病（Bluetongue, BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起，由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病；主要侵害绵羊、山羊。BTV中存在大量的基因变异和抗原变异，导致其有26个不同的血清型，并且同一血清型内含有大量的变异毒株。由于不同血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，这为有效的多价疫苗的研究带来困难。血清型特异性诊断方法的研究对控制BT有重要意义。BTV VP2蛋白是决定病毒血清型特异性的主要结构蛋白，在本研究中，我们通过杆状病毒表达系统表达真核重组BTV16VP2蛋白，并以此为免疫原免疫BALB/c小鼠制备了两株针对BTV16型VP2蛋白血清型特异性单克隆抗体（MAbs）。为鉴定两株型特异性MAbs所识别的抗原表位，我们设计了87对引物（每对引物编码16个氨基酸，87对引物覆盖BTV16型VP2蛋白全长，相邻两对引物含有5个氨基酸重叠区，以最大限度保持VP2蛋白上的线性表位），通过原核表达方法表达出87条麦芽糖结合蛋白（MBP）融合短肽，以此作为包被抗原通过间接ELISA方法筛选两株MAbs所识别的表位区域，并利用肽扫描技术合成一系列逐渐缩短的短肽来确定两株MAbs所识别的最小表位区域：MAbs3G10识别34EWSGHDVTEIPNRRMF49；MAbs2B4识别543DPYVKRTVK555。对所鉴定表位在BTV16型不同地区分离株、BTV1-26个血清型以及呼肠孤病毒科环状病毒属内的代表病毒进行氨基酸序列比对，结果显示所鉴定的两个表位在16型内不同毒株间是高度保守的，而在BTV不同血清型间及同一病毒属内的不同病毒之间差异明显。所制备的两株型特异性MAbs以及两个BTV16VP2蛋白线性B细胞表位为血清型特异性诊断方法的建立和表位疫苗的设计奠定了基础。研究发现尽管宿主机体产生的大部分中和抗体是针对VP2蛋白的，但VP5蛋白也影响BTV的血清型，可能是通过在病毒粒子外衣壳上影响VP2蛋白的空间构象而间接发挥作用。最近研究发现仅有VP2蛋白，尽管能够诱导机体产生中和抗体免疫应答，却不能为宿主提供抵抗BTV感染的有效保护。然而，当VP2和VP5联合使用时（不管是以重组蛋白还是以重组病毒的形式免疫机体），保护率大大提高。但是到目前为止，VP5和VP2蛋白协同影响免疫保护反应的机制还不完全为人所知。目前，关于体液免疫中宿主机体所识别的VP5蛋白上的B细胞表位鲜有报道，在本研究中我们制备了五株针对16型病毒VP5蛋白MAbs，并通过原核表达方式表达一系列涵盖VP5蛋白全长的MBP融合短肽来确定MAbs所识别的B细胞表位。并通过肽扫描技术合成一系列短肽进行精确定位，最终鉴定三个B细胞表位： MAb3B11和3G9识别310ITANTREIQHIKEE323； MAb4A6识别188STMVKEYRQKIDALKA203；MAb2B10识别265LSGID269。氨基酸序列比对结果显示所鉴定的三个表位在BTV16型内不同毒株间是完全保守的。所制备的MAbs及其所识别的表位为进一步研究VP5蛋白功能，深入探讨在机体免疫应答中VP5蛋白所发挥的作用奠定了基础。
安鹏丽[8]（2013）在《树突状细胞提呈重组口蹄疫病毒结构蛋白VP1-VP4抗原的机制》文中进行了进一步梳理口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus，FMDV）感染偶蹄类动物所引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，目前还没有安全有效的防控措施。实验证明，FMDV野毒株并不感染树突状细胞（Dendritic cells，DCs），但被中和抗体IgG调理的FMDV不仅可以感染DCs，导致其抗原提呈功能丧失，而且还造成DCs大量死亡。当DCs负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞，并产生很好的免疫保护。因此，人们开始重视机体对FMDV细胞免疫应答机制的研究。而启动细胞免疫应答需要DCs的抗原提呈，但目前尚未见此类研究报道。本研究通过构建pET32a-VP1-VP4原核表达体系，表达重组VP1-VP4结构蛋白，并进行FITC标记。通过将甘露糖受体（mannose receptor, MR）抑制剂、清道夫受体（scavenger receptor, SR）抑制剂、巨吞饮抑制剂、Hsp90抑制剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体酸化和溶酶体酶抑制剂、循环内体转运抑制剂以不同组合处理骨髓源树突状细胞（BMDCs），再用VP1-VP4负载BMDCs。利用激光共聚焦荧光显微镜、流式细胞术和ELISA等方法检测BMDCs对VP1-VP4摄取、加工与呈递的动力学过程。激光共聚焦显微镜观察发现，在正常组BMDCs，被摄取的VP1-VP4-FITC抗原位于早期内吞小体，并且细胞内抗原的量随着摄取时间增加而增加，形成的内吞小体逐渐增大。抑制巨吞饮后的BMDCs内含VP1-VP4的内吞小体显着减少，说明巨吞饮是BMDCs摄取VP1-VP4的主要方式。而经MR抑制剂或SR抑制剂处理的BMDCs在不同时间出现VP1-VP4抗原摄取量增加的变化，表明MR与SR对VP1-VP4的识别可抑制BMDCs的抗原摄取功能。在经溶酶体酶抑制剂处理的BMDCs，可见VP1-VP4-FITC抗原在溶酶体内的积累，说明溶酶体在抗原的降解过程中发挥重要作用。分别抑制Hsp90或蛋白酶体之后，VP1-VP4抗原在BMDCs内的聚集均显着增加。当同时抑制Hsp90与蛋白酶体后，这种聚集的增加更加显着，甚至形成单一的形态巨大的抗原聚集小泡。这提示Hsp90在将内吞小体中的VP1-VP4转运到细胞质中发挥重要作用。用VP1-VP4负载BMDCs，并与淋巴结T细胞共培养，然后用流式细胞仪对BMDCs进行检测，结果显示BMDCs表面MHC II表达量升高，CD11c的表达量略有减少，表明VP1-VP4可以活化BMDCs。抑制溶酶体酶的活性之后，MHC II表达量变化较小，但是CD11c表达水平降低。抑制循环内体的转运功能之后，MHC II的表达显着升高，几乎呈全阳性表达，在同时抑制循环内体与溶酶体的BMDCs，MHCII表达量更高，同时CD11c的表达也明显升高，但不同处理组BMDCs的CD80表达水平都非常低，这提示BMDCs还可能存在其他降解VP1-VP4抗原的机制。用ELISA检测发现，负载VP1-VP4抗原的BMDCs与T细胞共培养的上清液中含有大量的IFN-γ和IL-17，而IL-4和TGF-β1的含量极低。无论抑制Hsp90、蛋白酶体，还是溶酶体，都会引起IFN-γ水平极显着降低（P<0.01），证明Hsp90、蛋白酶体和溶酶体在FMDV VP1-VP4抗原加工过程中发挥非常重要的作用。值得注意的是，小剂量Hsp90抑制剂组（200nmol/mL）产生IFN-γ的量高于大剂量组（1μmol/mL），在各个时间点均有极显着差异（P<0.01），并且Hsp90抑制剂与蛋白酶体抑制剂同时使用后表现相同的趋势。但是大剂量Hsp90抑制剂（1μmol/mL）与蛋白酶体抑制剂同时使用组产生IFN-γ的量高于单独使用Hsp90抑制剂组，而小剂量Hsp90抑制剂（200nmol/mL）与蛋白酶体抑制剂同时使用组产生IFN-γ的量低于单独使用Hsp90抑制剂组。推测当Hsp90被高度抑制之后，保存完好的抗原表位可以通过溶酶体途径进行提呈，产生较高水平的IFN-γ。Primaquine能阻断内吞小体重返细胞膜的过程。在抑制蛋白酶体的前提下，用大剂量Primaquine（100nmol/mL）处理的BMDCs刺激T细胞产生IFN-γ的量远远低于小剂量组（50nmol/mL），这表明交叉提呈途径在BMDCs提呈VP1-VP4抗原的过程中起着非常重要的作用。通过对IL-17的检测发现，IL-17的含量都非常高（含Chloroquine的处理组除外），并且迅速达到释放量的峰值（48h之内），72和96h各处理组所产生IL-17的量没有显着差异（P＞0.05），并且各处理组IL-17检测水平与本组对应时间点上IFN-γ的释放趋势保持一致。值得注意的是，IFN-γ的浓度在96h内呈现持续升高的变化趋势，而IL-17在48h内达到峰值。从以上结果可以得出结论：BMDCs主要通过巨吞饮的方式摄取VP1-VP4抗原，在细胞内形成包裹VP1-VP4的内吞小体，后者与溶酶体融合，VP1-VP4由此被降解，产生的抗原表位与MHC II分子结合，提呈给CD4+T细胞。内吞小体中的VP1-VP4也可被Hsp90转运到细胞质基质中被蛋白酶体降解，产生的抗原表位被MHC I分子交叉提呈给CD8+T细胞。内吞小体也可通过再循环机制将VP1-VP4提呈给T细胞。被激活的T细胞释放大量的IFN-γ和IL-17。
郭龙军[9]（2012）在《猪圆环病毒2型不同基因型毒株的遗传变异、抗原表位及其致病性研究》文中研究表明猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）为圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员,包括PCV1（Porcine circovirus type1, PCV1）和PCV2（Porcine circovirus type2.PCV2）两种基因型,其中PCV1为PK15细胞系的一种污染物,对猪无致病性；而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原。近年来PCV2已成为威胁世界养猪业的重要病原之一,并带来巨大的经济损失。目前国际上对PCV2命名进行规范（www.pcvd.net）,主要分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三种基因型。猪群中PCV2a和PCV2b两种基因型广泛存在,自2004年以来主要以PCV2b基因型流行为主。PCV2c基因型仅二十世纪八十年代于丹麦报道,目前尚无流行。鉴于我国猪群PCV2感染广泛存在且危害严重,本研究对我国PCV2分子流行病学、抗原表位及其致病性进行系统研究,旨在为PCV2防控及致病机制研究奠定基础。本研究对我国部分地区PCV2分子流行病学调查,分离到19个PCV2流行毒株。该19株病毒分为PCV2a、PCV2b和PCV2d三个基因型,各占10.5%、73.7%和15.8%,其中PCV2d为新出现的基因型。4株病毒为1766nt,以1767nt毒株为基准,其第39或1039位有1个碱基缺失后突变成1766nt毒株。对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705nt和708nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸延伸。本试验选用AccⅠ和FbaⅠ内切酶对该19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）,结果表明该方法可作为流行毒株分型鉴别手段。研究表明,我国猪群中流行的PCV2毒株以PCV2b基因型为主,同时也出现了PCV2d新基因型及基因组为1766nt的变异毒株。此外,试验也证实上述毒株的ORF2编码Cap蛋白的C末端有突变现象,表明我国PCV2流行毒株呈现多样性。PCV2-ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起免疫保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。5株单抗中有4株均属于同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36另1株单抗（1D2）仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,填补了核定位信号区抗原表位研究的空白,为进一步Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。PCV2感染引起的相关疾病日益严重,流行毒株基因不断发生变异,根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型,还有PCV2d基因型新报道,这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）等证实属于不同基因型的PCV2毒株；拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50/mL;用具有中和病毒活性的单克隆抗体（1D2）进行抗原捕获ELISA检测,拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应,另3个克隆毒株（PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH）与该单抗均无反应,表明属于不同基因型代表毒株。我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型,其病毒抗原特性各异,构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株,为进一步研究其致病性差异奠定了基础。有关PCV2不同基因型自然重组的报道不断增多,其重组与病毒致病性和遗传进化关系尚不明确。本研究PK15细胞系模拟PCV2a和PCV2b不同基因型体外自然重组模型,选PCV2a基因型代表毒株PCV2a/CL1分别与两株PCV2b基因型代表毒株PCV2b/JF11和PCV2b/YJ进行共感染PK15,获得PCV2b（JF11）/2a（CL1）和PCV2b（YJ）/2a（CL1）两株不同基因型PCV2重组突变毒株,该重组突变毒株分别以其PCV2b基因型亲本毒为骨架,将其基因组位置1018nt～1767/1768nt分别替换为亲本毒PCV2a/rCL的相应基因片段,体外试验表明,与其亲本毒相比,该两株重组突变毒株体外复制效率显着增强,其抗原性也发生明显改变。为评价PCV2不同基因型、PCV2突变毒株及不同基因型PCV2重组毒株致病性差异,本研究分别选取PCV2不同基因型代表毒株PCV2a/rCL、PCV2b/rJF和PCV2d/rBDH; PCV2b基因型突变毒株PCV2b/rYJ;不同基因型PCV2重组代表毒株PCV2b（YJ）/2a（CL1）及其亲本毒进行动物感染试验,结果表明,与经典的PCV2a和PCV2b相比,新出现的PCV2d基因型PCV2d/rBDH及PCV2b突变毒株PCV2b/rYJ致病性显着增强（p<0.05）,PCV2a和PCV2b基因型间致病性差异不显着（p>0.05）。此外,重组毒PCV2b（YJ）/2a（CL1）致病性与其亲本毒PCV2a/rCL1相似,但明显弱于其亲本毒PCV2b/rYJ（p<0.05）。有关PCV2致病机制尚不明确,本研究以非致病性PCV1基因组为骨架,分别替换PCV2-ORF2基因去除核定位信号区的相应基因片段及其相互重叠的截短基因片段,通过感染性克隆技术拯救嵌合病毒。对拯救的PCV嵌合病毒进行IPMA鉴定及测序,结果表明已成功获得3株PCV嵌合病毒,为进一步致病性研究奠定基础。
孙英军[10]（2012）在《口蹄疫病毒非结构蛋白致免疫应答差异的分析》文中指出目前商品化的口蹄疫疫苗大多是化学灭活苗，该疫苗在预防和控制乃至根除口蹄疫过程中发挥重要作用。口蹄疫灭活疫苗主要依靠体液免疫发挥作用，细胞免疫和非结构蛋白免疫的作用往往被忽视，同时灭活疫苗也存在免疫持续期短的缺点。众多科研人员认为CD4+T细胞应答在口蹄疫保护性应答中具有重要意义，并且认为免疫持续期的长短与病毒特异性的CD4+T细胞数量有一定的关联。融合口蹄疫病毒非结构蛋白2B基因后可以显着提高腺病毒载体疫苗诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞应答的水平。在FMDV非结构蛋白上鉴定的大量的CD4+、CD8+T细胞表位，也进一步证明非结构蛋白在诱导细胞免疫方面具有不可忽视的作用。本研究利用结构蛋白相同，而非结构蛋白不同的毒株，在豚鼠和猪体内进行免疫差异分析，具体如下：（1）在豚鼠体内的免疫应答差异和保护率差异本研究选用反向遗产操作技术构建的与野生型毒株（Mya98/BY/2010）相同P1基因而非结构蛋白和前导蛋白不同的重组病毒（分别命为Re-Mya98/BY/2010和Mya98/BY/2010）作为抗原，选用相同剂量病毒液，经BEI灭活后与4种佐剂乳化制备不同的疫苗作为免疫原免疫豚鼠。利用流式细胞仪检测外周血液中CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的含量，ELISA方法检测豚鼠血清中抗体应答，在免疫28天时进行攻毒实验。抗原剂量相同的条件下，Re-Mya98/BY/2010和Mya98/BY/2010诱导的抗体应答之间没有显着性差异（P>0.05）。两种抗原均能诱导CD4+和CD8+T细胞应答，CD4+T细胞应答没有显着性差异（P>0.05）。Re-Mya98/BY/2010比Mya98/BY/2010更有效的诱导CD8+T细胞亚群分化。免疫Re-Mya98/BY/2010疫苗的保护率分别达到100%，83.33%，100%和50%，而免疫Mya98/BY/2010疫苗保护率仅为20%，0，17%和25%，结果表明融合了不同的非结构蛋白的重组口蹄疫病毒抗原能够诱导与保护率相关的CD8+T细胞应答。（2）在猪体内的免疫应答差异和保护率差异挑选免疫效果较好的，ISA206佐剂乳化的口蹄疫灭活疫苗进行猪体实验，采用同样的方法监测免疫猪的细胞免疫和体液免疫水平。两种疫苗的攻毒保护率都达到100%。液相阻断ELISA结果表明两种抗原在诱导抗体应答上并无显着差异（P>0.05）。Re-Mya98/BY/2010诱导更多数量CD3+T淋巴细胞分化。第7天，免疫Re-Mya98/BY/2010的实验组CD4+和CD8+T淋巴细胞含量升高，并且显着高于免疫Mya98/BY/2010抗原的实验组（P<0.05）。上述结果表明，完整的非结构蛋白可以增强猪体早期的CD4+和CD8+T细胞应答。（3）差异肽段对猪和牛淋巴细胞刺激差异分析我们合成了非结构蛋白上的28条差异肽段，利用基于CFSE的淋巴细胞增殖实验探讨造成免疫差异的原因。实验发现：Re-Mya98/BY/2010与Mya98/BY/2010前导蛋白上2-11氨基酸和3D上2001-2014位氨基酸具有刺激猪源淋巴细胞增殖的作用，前导蛋白上2-11位氨基酸和3A上1493-1510位氨基酸具有刺激牛源淋巴细胞增殖的作用。位于前导蛋白、3A、3D上的多肽刺激猪源或牛源淋巴细胞增殖的比率与其他多肽具有极显着差异（P<0.05）。用前导蛋白上的2-11的肽段免疫FMDV致敏的猪，发现该多肽都能刺激猪外周血中CD8+T细胞亚群分化。结果表明在两种口蹄疫病毒抗原前导蛋白和3A上可能存在具有差异性的T细胞表位。本实验结果表明，重组的口蹄疫病毒能够诱导较高的体液免疫和细胞免疫，进一步说明非结构蛋白在诱导免疫应答方面具有显着的作用。包含流行毒株衣壳的重组口蹄疫疫苗能诱导保护性免疫应答，具有应用于口蹄疫免疫防控的前景。
二、用肽ELISA区分抗FMD接种动物和康复动物（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用肽ELISA区分抗FMD接种动物和康复动物（论文提纲范文）
（1）双抗体夹心ELISA检测羊肠道病毒抗原方法的建立与应用及病毒VP1蛋白抗原表位的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肠道病毒的分类及感染概况 |
| 1.2 肠道病毒的基因组结构及编码的蛋白功能 |
| 1.3 动物肠道病毒感染 |
| 1.4 肠道病毒的诊断方法 |
| 1.5 单克隆抗体概况 |
| 1.6 单克隆抗体的制备方法 |
| 1.7 单克隆抗体的研究进展 |
| 1.8 有关单克隆抗体的展望 |
| 1.9 抗原表位的鉴定方法 |
| 1.10 抗原表位的应用 |
| 第二章 CEV-JL14结构蛋白基因VP1的原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗CEV-VP1单克隆抗体的制备与特性鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 羊肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 羊肠道病毒双抗体夹心ELISA试剂盒的组装与应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 羊肠道病毒CEV-JL14 VP1蛋白抗原表位的鉴定 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体制备、抗原位点鉴定及竞争ELISA方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫病原学 |
| 1.2 口蹄疫的流行现状 |
| 1.2.1 世界范围内的流行 |
| 1.2.2 国内流行现状 |
| 1.3 口蹄疫的防控措施 |
| 1.3.1 口蹄疫的预防 |
| 1.3.2 口蹄疫的检测 |
| 1.4 口蹄疫病毒抗原表位 |
| 1.5 单克隆抗体 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第2章 口蹄疫病毒 3B单克隆抗体制备与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒株、细胞、动物、质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 3B基因扩增与构建 |
| 2.2.2 3B蛋白表达与纯化 |
| 2.2.3 动物免疫与效价检测 |
| 2.2.4 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.2.6 腹水的制备 |
| 2.2.7 单克隆单体亚型鉴定 |
| 2.2.8 单克隆抗体效价检测 |
| 2.2.9 单克隆抗体的Western-blot检测 |
| 2.2.10 单抗的间接免疫荧光检测 |
| 2.2.11 单抗的中和抗体效价检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 pET-30a-3B表达载体的构建 |
| 2.3.2 pET-30a-3B原核表达 |
| 2.3.3 pET-30a-3B可溶性分析 |
| 2.3.4 pET-30a-3B纯化 |
| 2.3.5 Western blotting检测 |
| 2.3.6 免疫效价检测 |
| 2.3.7 间接ELISA方法条件的确立 |
| 2.3.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.3.9 腹水制备 |
| 2.3.10 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 2.3.11 抗体效价的检测 |
| 2.3.12 抗体Western blotting检测 |
| 2.3.13 抗体间接免疫荧光检测 |
| 2.3.14 抗体中和效价检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 3B单抗的表位鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒、菌种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验相关设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 3B蛋白的拆分，重组质粒的构建 |
| 3.2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.3 反应原性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 3B拆分蛋白的纯化 |
| 3.3.2 反应性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 口蹄疫 3B蛋白竞争ELISA方法的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 实验相关设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 FMDV血清的筛选 |
| 4.2.2 阳性血清和 3B拆分蛋白的反应性鉴定 |
| 4.2.3 竞争ELSIA方法的建立 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 临床FMDV血清筛选 |
| 4.3.2 阳性血清和 3B拆分蛋白反应性鉴定 |
| 4.3.3 竞争ELISA方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）口蹄疫病毒非结构蛋白2C影响宿主先天性免疫的机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 图表目录 |
| 单词缩写表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 基因组 |
| 1.2 病毒的生活周期 |
| 1.2.1 吸附、渗透和脱壳 |
| 1.2.2 生物合成 |
| 1.2.3 病毒组装与释放 |
| 1.3 致病机理 |
| 1.4 宿主应答 |
| 1.5 FMD的防控 |
| 1.5.1 疫病诊断 |
| 1.5.2 疫苗接种 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 第二章 验证FMDV 2C与IFP35的相互关系 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料及试剂配制 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 免疫共沉淀(Co-IP)质粒鉴定表达 |
| 2.2.2 免疫共沉淀(Co-IP)检测FMDV 2C蛋白与IFP35蛋白相互作用关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 FMDV 2C蛋白诱导Ⅰ型干扰素表达 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料及试剂配制 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 人源蛋白重组质粒pEGFP-N1-Nmi的构建 |
| 3.2.2 蛋白重组质粒鉴定表达 |
| 3.2.3 FMDV-2C、细胞蛋白Nmi及细胞蛋白IFP35对细胞因子转录的影响 |
| 3.2.4 Real-time PCR检测2C和Nmi对Ⅰ型干扰素表达的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 沉默细胞内源性IFP35基因分析FMDV 2C和Nmi对先天性免疫的影响 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料及试剂配制 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 干扰细胞内源性IFP35的表达 |
| 4.2.2 点突变重组质粒pEGFP-N1-IFP35的构建 |
| 4.2.3 干扰细胞内源性IFP35表达后FMDV-2C与细胞蛋白Nmi对细胞因子转录的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 FMDV 2C蛋白诱导Ⅰ型干扰素对VSV复制的影响 |
| 5.1 实验材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料及试剂配制 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 FMDV-2C蛋白和细胞蛋白Nmi对VSV病毒复制的影响 |
| 5.2.2 抗Ⅰ型干扰素的抗体可以消除FMDV 2C蛋白对VSV复制的抑制作用 |
| 5.2.3 干扰内源性IFP35表达通过抑制Ⅰ型干扰素从而促进VSV的增殖 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 本论文的讨论、创新点与研究展望 |
| 6.1 发现了FMDV 2C与细胞蛋白Nmi诱导Ⅰ型干扰素表达 |
| 6.2 证实了IFP35在此过程中发挥着重要作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文情况 |
（4）小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 小反刍兽疫疫苗研究进展 |
| 1.1.1 PPR 简介 |
| 1.1.2 PPR 弱毒疫苗 |
| 1.1.3 重组标记疫苗 |
| 1.1.4 小结与展望 |
| 1.2 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 口蹄疫简介 |
| 1.2.2 灭活抗原疫苗 |
| 1.2.3 新型分子疫苗 |
| 1.2.4 基础研究在合理设计 FMD 疫苗中的作用 |
| 1.3 羊痘病毒研究进展 |
| 1.3.1 羊痘简介 |
| 1.3.2 羊痘病毒基因组研究进展 |
| 1.3.3 羊痘疫苗研究进展 |
| 1.3.4 羊痘病毒活载体研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组转移载体的设计、构建与功能验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 重组质粒的设计 |
| 2.1.3 重组质粒的构建 |
| 2.1.4 启动子 p11 和 p7.5 功能的验证 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段 PCR 结果 |
| 2.2.2 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2.3 重组质粒测序结果 |
| 2.2.4 转染 LT 细胞结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 同源臂的设计 |
| 2.3.2 载体设计与构建策略 |
| 2.3.3 启动子功能的验证 |
| 第三章 重组山羊痘病毒的产生与纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 重组质粒的制备 |
| 3.1.3 GPV 基因组 DNA 的提取 |
| 3.1.4 重组质粒与 GPV 共转染 LT 细胞 |
| 3.1.5 重组 GPV（rGPV）的筛选与纯化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒转染 LT 细胞的结果 |
| 3.2.2 重组 GPV 的筛选结果 |
| 3.2.3 重组 GPV 的纯化结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 同源重组的基本过程 |
| 3.3.2 痘病毒基因组 DNA 的复制 |
| 3.3.3 提高同源重组的效率 |
| 3.3.4 重组 GPV 的筛选策略 |
| 3.3.5 重组 GPV 的纯化 |
| 第四章 重组山羊痘病毒外源基因的鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 RT-PCR 检测 rGPV 外源基因的转录 |
| 4.1.3 rGPV 中外源基因表达产物的检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 rGPV 中外源基因 RT-PCR 结果 |
| 4.2.2 rGPV 中外源基因的表达结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 病毒基因转录的特点 |
| 4.3.2 痘病毒基因转录的主要元件和转录后加工 |
| 4.3.3 病毒蛋白的翻译及其翻译后加工 |
| 4.3.4 rGPV 中外源基因的转录和翻译 |
| 第五章 rGPV 的免疫效果测定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂及疫苗制备 |
| 5.1.2 动物分组及免疫程序 |
| 5.1.3 抗体水平及效价测定 |
| 5.1.4 数据统计及分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 rGPV 病毒滴度 |
| 5.2.2 抗体水平与效价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 痘病毒感染的免疫反应 |
| 5.3.2 抗体水平的变化 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗原表位概述 |
| 1.1.1 表位的分类 |
| 1.1.2 抗原的递呈过程 |
| 1.2 抗原表位的研究 |
| 1.2.1 表位疫苗的研究 |
| 1.2.2 表位的诊断研究 |
| 1.3 抗原表位的分析方法 |
| 1.3.1 B 细胞抗原表位的研究方法 |
| 1.3.2 T 细胞抗原表位的研究方法 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒概述 |
| 1.5 生物学特性 |
| 1.5.1 病原学及分类 |
| 1.5.2 DTMUV 的形态结构 |
| 1.5.3 TMUV 的基因组学研究进展 |
| 1.5.4 TMUV 的基因组编码蛋白 |
| 1.5.4.1 结构蛋白 |
| 1.5.4.2 非结构蛋白 |
| 1.6 分子免疫学及分子生物学诊断方法研究进展 |
| 1.6.1 病毒分离 |
| 1.6.2 分子诊断方法 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞、动物 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DTMUV YY5 株 E 蛋白的可溶性表达与抗原性分析 |
| 2.2.1.1 引物 |
| 2.2.1.2 E 基因的扩增 |
| 2.2.1.3 PCR 产物的克隆与测序 |
| 2.2.1.4 连接产物转化 |
| 2.2.1.5 重组质粒 MBP-E 的构建 |
| 2.2.1.6 重组质粒的诱导表达和纯化 |
| 2.2.1.7 Western blot 检测融合蛋白多抗血清的免疫反应性 |
| 2.2.2 鸭坦布苏病毒 E 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.2.1 单克隆抗体制备技术路线 |
| 2.2.2.2 抗原制备 |
| 2.2.2.3 动物免疫 |
| 2.2.2.4 SP2/0 骨髓瘤细胞的复苏 |
| 2.2.2.5 免疫脾细胞的制备 |
| 2.2.2.6 饲养细胞的制备 |
| 2.2.2.7 细胞融合 |
| 2.2.2.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.2.2.9 间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清 |
| 2.2.2.10 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法） |
| 2.2.2.11 单克隆抗体的生产 |
| 2.2.2.12 单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）分析 |
| 2.2.2.13 单克隆抗体的 Western blot 鉴定 |
| 2.2.3 鸭坦布苏病毒 E 蛋白抗原表位的鉴定 |
| 2.2.3.1 短肽融合蛋白的设计 |
| 2.2.3.2 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达 |
| 2.2.3.3 抗原表位的初步鉴定 |
| 2.2.3.4 抗原表位的精确鉴定 |
| 2.2.3.5 抗原表位的印证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 E 蛋白的可溶性表达 |
| 3.1.1 E 基因的扩增 |
| 3.1.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.1.3 MBP-E 融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.1.4 重组蛋白的 Western Blot 分析 |
| 3.2 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞株的获得 |
| 3.2.2 间接免疫荧光（IFA）鉴定结果 |
| 3.2.3 Western blot 结果 |
| 3.3 E 蛋白抗原表位的鉴定 |
| 3.3.1 短肽融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 短肽蛋白的 Western blot 分析和 ELISA 分析 |
| 3.3.3 抗原表位示意图 |
| 3.3.4 抗原表位的印证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭坦布苏病毒 E 蛋白的可溶性表达 |
| 4.2 鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备 |
| 4.3 E 蛋白抗原表位的鉴定 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 作者简介及硕士期间发表论文情况 |
| 附录 |
（6）3A与3B表位串联抗原的口蹄疫鉴别诊断ELISA的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 口蹄疫及其危害 |
| 1.2 近年来口蹄疫亚洲流行现状 |
| 1.3 口蹄疫病毒非结构蛋白及其功能 |
| 1.3.1 前导蛋白酶（Lpro） |
| 1.3.2 2A、2B 和 2C |
| 1.3.3 NSP 3A 和 NSP 3B |
| 1.3.4 3C 蛋白酶（3Cpro） |
| 1.3.5 3D 聚合酶（3Dpol） |
| 1.4 表位鉴别诊断技术研究进展 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和血清 |
| 2.1.2 主要酶类及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 表位的选择及引物的设计 |
| 2.2.2 PCR 反应扩增 3A、3B 片段 |
| 2.2.3 克隆载体 pET-32a-3AF/3BF 的构建 |
| 2.2.4 基因串联表达载体 pET-32a-n+的构建 |
| 2.2.5 目的蛋白的表达和 Western blot 鉴定 |
| 2.2.6 牛 FMDV 抗体间接 ELISA 检测方法的标准化 |
| 2.2.7 特异性试验 |
| 2.2.8 敏感性试验 |
| 2.2.9 重复性试验 |
| 2.2.10 与 3 种同类商品化试剂盒的比较 |
| 2.2.11 FMDV r-3AB 串联肽间接 ELISA 方法的初步应用 |
| 2.2.12 奶液样品检测的的探索 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 3A、3B 短肽基因的 PCR 扩增结果 |
| 3.2 串联肽重组表达载体的构建 |
| 3.3 串联蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化 |
| 3.3.1 串联蛋白的诱导表达 |
| 3.3.2 串联蛋白的纯化 |
| 3.4 串联蛋白的 western blot 鉴定 |
| 3.5 牛 FMDV 抗体间接 ELISA 方法的建立及标准化 |
| 3.5.1 r3AB-ELISA 相关条件的确定 |
| 3.5.2 r3AB-ELISA 检测方法临界值的确定 |
| 3.6 r3AB-ELISA 检测方法特异性和敏感性试验 |
| 3.7 r3AB-ELISA 方法的重复性检测试验 |
| 3.8 FMDV 抗体间接 ELISA 与同类商品化试剂盒的比较 |
| 3.9 FMDV 抗体间接 ELISA 方法初步应用 |
| 3.10 FMDV 抗体间接 ELISA 方法用于奶液的检测 |
| 3.10.1 奶液样本的处理 |
| 3.10.2 奶液 ELISA 的最终操作步骤 |
| 3.10.3 奶液阳性样本的最低检出限量 |
| 3.10.4 奶液临床样本的初步检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 选择重组串联蛋白建立间接 ELISA 检测方法的依据 |
| 4.2 ELISA 临界值及可疑区间的判定 |
| 4.3 ELISA 方法中相关条件的选择 |
| 4.4 表位串联抗原用于奶样检测的可行性研究 |
| 5. 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）蓝舌病病毒16型VP2、VP5蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定（论文提纲范文）
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蓝舌病概述 |
| 1.1.1 BTV 的分类地位与病原学特性 |
| 1.1.2 当前全球范围内 BTV 分布趋势 |
| 1.1.3 BT 临床症状及病理变化 |
| 1.1.4 BT 预防 |
| 1.1.5 BTV 生命周期 |
| 1.1.6 BTV 编码蛋白质及生物学功能 |
| 1.2 BTV VP2、VP5 抗原表位研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 BTV16 VP2 蛋白血清型特异性单克隆抗体制备及抗原表位鉴定 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、质粒、病毒和实验动物 |
| 2.1.2 真核重组 BTV16 VP2 蛋白表达、纯化及生物学活性鉴定 |
| 2.1.3 BTV16 VP2 蛋白血清型特异性单克隆制备及特性鉴定 |
| 2.1.4 BTV16 VP2 蛋白截短表达 |
| 2.1.5 BTV16 VP2 蛋白血清型特异性抗原表位鉴定 |
| 2.1.6 BTV16 VP2 蛋白血清型特异性 B 细胞表位保守性分析 |
| 2.1.7 MAbs 与 BTV16 型病毒不同地区分离株相应表位区域的反应性 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 BTV16 VP2 基因 PCR 扩增 |
| 2.2.2 真核重组 BTV16 VP2 蛋白表达与纯化鉴定 |
| 2.2.3 真核重组 BTV16 VP2 蛋白生物学活性鉴定 |
| 2.2.4 BTV16 VP2 蛋白 MAbs 生物学活性鉴定 |
| 2.2.5 87 条 MBP 融合短肽的原核表达 |
| 2.2.6 BTV16 VP2 蛋白 MAbs 抗原表位初步鉴定 |
| 2.2.7 BTV16 VP2 蛋白 MAbs 抗原表位精确鉴定 |
| 2.2.8 抗原表位保守型和特异性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 BTV16 VP5 蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、质粒、病毒和实验动物 |
| 3.1.2 BTV16 VP5 蛋白原核表达、纯化及鉴定 |
| 3.1.3 BTV16 VP5 蛋白真核表达、纯化及鉴定 |
| 3.1.4 MBP-BTV16 VP5d41aa 和 His6-BTV16 VP5d41aa 蛋白生物活性鉴定 |
| 3.1.5 BTV16 VP5 蛋白 MAbs 制备及特性鉴定 |
| 3.1.6 BTV16 VP5 蛋白截短表达 |
| 3.1.7 BTV16 VP5 蛋白抗原表位鉴定 |
| 3.1.8 BTV16 VP5 蛋白抗原表位保守性分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 MBP-BTV16 VP5 和 MBP-BTV16 VP5d41aa 蛋白原核表达分析鉴定 |
| 3.2.2 真核重组蛋白 His6-BTV16 VP5 和 His6-BTV16 VP5d41aa 表达鉴定 |
| 3.2.3 MBP-BTV16 VP5d41aa 和 His6-BTV16 VP5d41aa 蛋白生物活性鉴定 |
| 3.2.4 BTV16 VP5 蛋白 MAbs 制备和特性鉴定 |
| 3.2.5 BTV16 VP5 蛋白截短表达 |
| 3.2.6 BTV16 VP5 蛋白抗原表位鉴定 |
| 3.2.7 BTV16 VP5 蛋白抗原表位保守性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）树突状细胞提呈重组口蹄疫病毒结构蛋白VP1-VP4抗原的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 1 引言 |
| 1.1 口蹄疫研究进展 |
| 1.1.1 FMDV 流行病学 |
| 1.1.2 FMDV 病原学 |
| 1.1.3 FMDV 受体结合位点 |
| 1.1.4 FMDV 引起的亚临床感染和持续性感染 |
| 1.1.5 FMDV 疫苗研究进展 |
| 1.2 树突状细胞研究进展 |
| 1.2.1 DCs 的来源 |
| 1.2.2 DCs 的分化和成熟 |
| 1.2.3 DCs 的抗原捕获功能 |
| 1.2.4 DC 的抗原提呈途径 |
| 1.2.5 DC与FMDV的关系 |
| 1.3 DCs 激活特异性 T 淋巴细胞应答 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 试验材料及仪器 |
| 2.1 主要试验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验相关试剂配制 |
| 2.3.1 重组菌的培养和诱导表达用液 |
| 2.3.2 SDS-PAGE 相关溶液 |
| 2.3.3 电洗脱用液 |
| 2.3.4 细胞培养用液 |
| 2.3.5 用于细胞爬片荧光标记前预处理的溶液 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 重组 VP1-VP4 蛋白的纯化 |
| 3.1.1 菌株选择 |
| 3.1.2 重组菌的诱导表达 |
| 3.1.3 SDS-PAGE 凝胶的制备 |
| 3.1.4 表达产物 VP1-VP4 蛋白的 SDS- PAGE 电泳 |
| 3.1.5 目的蛋白的回收纯化及电洗脱 |
| 3.2 淋巴结 T 细胞和骨髓源树突状细胞的制备 |
| 3.2.1 试验动物 |
| 3.2.2 小鼠颈浅淋巴结内 T 细胞的制备 |
| 3.2.3 骨髓源树突细胞的制备 |
| 3.3 激光共聚焦荧光显微镜观察细胞摄取 VP1-VP4 抗原的动力学过程 |
| 3.3.1 FITC 标记 FMDV VP1-VP4 重组蛋白 |
| 3.3.2 玻片预处理 |
| 3.3.3 制备细胞爬片 |
| 3.3.4 试验组处理 |
| 3.3.5 经抑制剂处理的 BMDCs 负载 FMDV VP1-VP4-FITC 重组蛋白 |
| 3.3.6 荧光标记步骤 |
| 3.4 流式细胞术分析负载 VP1-VP4 融合蛋白的 BMDCs 与 T 细胞作用之后细胞表面分子的表达水平 |
| 3.5 ELISA 检测负载 VP1-VP4 蛋白的 BMDCs 激活 T 细胞释放细胞因子的水平 |
| 3.5.1 抑制抗原提呈的 MHC I 分子途径 |
| 3.5.2 抑制抗原提呈的 MHC II 分子途径 |
| 3.5.3 抑制循环内体向细胞膜的转运 |
| 3.5.4 应用 ELISA 试剂盒测定共培养物中 IFN-γ的含量 |
| 3.5.5 应用 ELISA 试剂盒测定共培养物中 IL-4、TGF-β、IL-17 的含量 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 重组蛋白的诱导表达与纯化鉴定 |
| 4.1.1 重组菌的诱导表达和 SDS-PAGE 分析 |
| 4.1.2 重组 VP1-VP4 蛋白的纯化与浓度测定 |
| 4.2 BMDCs 的制备与表型鉴定 |
| 4.3 BMDCs 负载 VP1-VP4 蛋白之后细胞内动力学变化 |
| 4.3.1 BMDCs 摄取和加工 VP1-VP4-FITC 动力学观察 |
| 4.3.2 抑制 BMDCs 表面受体对摄取 VP1-VP4 抗原的影响 |
| 4.3.3 抑制溶酶体的作用对 BMDCs 加工 VP1-VP4 抗原的影响 |
| 4.3.4 抑制 Hsp90 和蛋白酶体对 BMDCs 摄取和加工 VP1-VP4 抗原的影响 |
| 4.3.5 蛋白酶体和溶酶体双抑制对 BMDCs 摄取和加工 VP1-VP4 抗原的影响 |
| 4.4 BMDCs 负载 VP1-VP4 蛋白并与 T 细胞共培养之后的表型变化 |
| 4.5 BMDCs 负载 VP1-VP4 蛋白之后对 T 细胞的活化 |
| 4.5.1 BMDCs 负载 VP1-VP4 蛋白之后激活 T 细胞产生 IFN-γ的水平 |
| 4.5.2 BMDCs 负载 VP1-VP4 蛋白之后激活 T 细胞产生 IL-4 的水平 |
| 4.5.3 BMDCs 负载 VP1-VP4 蛋白之后激活 T 细胞产生 TGF-β1 的水平 |
| 4.5.4 BMDCs 负载 VP1-VP4 融合蛋白之后激活 T 细胞产生 IL-17 的水平 |
| 5 讨论 |
| 5.1 抑制剂的作用原理 |
| 5.2 激光共聚焦荧光显微镜观察 BMDCs 对 VP1-VP4 抗原的加工处理 |
| 5.3 流式细胞术分析 BMDCs 负载 VP1-VP4 重组蛋白后的活化状态 |
| 5.4 负载 VP1-VP4 蛋白的 BMDCs 对淋巴结 T 细胞的活化作用 |
| 5.5 小结：负载 VP1-VP4 蛋白的 BMDCs 抗原提呈机制 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（9）猪圆环病毒2型不同基因型毒株的遗传变异、抗原表位及其致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 基因组结构 |
| 1.1.4 PCV流行病学 |
| 1.2 PCV转录表达和复制 |
| 1.2.1 PCV转录表达 |
| 1.2.2 PCV复制酶复合体 |
| 1.2.3 PCV复制 |
| 1.3 PVC2感染 |
| 1.3.1 PMWS起源 |
| 1.3.2 PCV2感染的临床特征 |
| 1.3.3 PCV2感染相关疾病 |
| 1.3.4 PCV2感染的病理特征 |
| 1.4 PCV2感染与宿主免疫 |
| 1.4.1 PCV2感染途径及传播 |
| 1.4.2 PCV2和宿主免疫 |
| 1.5 PCV重组 |
| 1.5.1 PCV2同种基因型间的重组 |
| 1.5.2 PCV2不同基因型间的重组 |
| 1.5.3 PCV1和PCV2间的重组 |
| 1.6 PCV2诊断技术 |
| 1.6.1 PMWS判断标准 |
| 1.6.2 PCV2感染实验室诊断技术 |
| 1.7 PCV2疫苗 |
| 1.7.1 目前可用的商品化PCV2 疫苗 |
| 1.7.2 试验 感染中商品化疫苗免疫效力 |
| 1.7.3 免疫策略 |
| 1.7.4 试验条件下PCV2新型疫苗 |
| 1.8 研究的目的和意义 第二章 我国部分地区PCV2流行毒株遗传变异分析 |
| 摘要 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病料来源及病毒分离 |
| 2.1.2 试剂及仪器 |
| 2.1.3 引物设计和PCR扩增 |
| 2.1.4 病毒基因组克隆及重组质粒鉴定 |
| 2.1.5 病毒全长基因核苷酸序列测定与分析 |
| 2.1.6 分离毒株基因组PCR-RFLP |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 病毒基因克隆及鉴定 |
| 2.2.2 病毒基因序列分析 |
| 2.2.3 PCV2分离毒株基因型鉴 定 |
| 2.2.4 碱基缺失与突变分析 |
| 2.2.5 ORF2编码Cap蛋白序列分析 |
| 2.2.6 遗传进化树的构建 |
| 2.2.7 分离毒株基因分型 |
| 2.3 讨论 第三章 PCV2-Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定 |
| 摘要 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的制备及标准毒株 |
| 3.1.2 试剂及仪器 |
| 3.1.3 Cap蛋白基因的截短扩增引物 |
| 3.1.4 Cap蛋白截短表达载体的构建 |
| 3.1.5 PCV2-Cap蛋白截短表达及Westernblot分析 |
| 3.1.6 肽扫 描法抗原表位鉴定 |
| 3.1.7 肽扫 描法抗原表位精确定位 |
| 3.1.8 核心序列与PCV2阳性血清反应原性鉴定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Cap蛋白截短表达基因扩增及鉴定 |
| 3.2.2 PCV2-Cap蛋白截短表达及Westernblot鉴定 |
| 3.2.3 PCV2-CapA段合成肽抗原表位鉴定 |
| 3.2.4 PCV2-CapA-b段合成肽抗原表位鉴定 |
| 3.2.5 PCV2-CapA-b-1段合成肽抗原表位精确定位 |
| 3.2.6 核心序列与PCV2阳性血清反应原性鉴定 |
| 3.3 讨论 第四章 PCV2不同基因型毒株感染性克隆构建及生物学特性 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、毒株、质粒及抗体 |
| 4.1.2 试剂及仪器 |
| 4.1.3 引物设计和PCR扩增 |
| 4.1.4 病毒基因组克隆及重组质粒鉴定 |
| 4.1.5 病毒基因组环化及DNA转染细胞 |
| 4.1.6 克隆毒株的拯救及免疫学 鉴定 |
| 4.1.7 克隆毒株电镜形态学观察 |
| 4.1.8 克隆毒株基因组测序及PCR-RFLP 分析 |
| 4.1.9 克隆毒株细胞传代毒价测定 |
| 4.1.10 克隆毒株感染细胞动力学测定 |
| 4.1.11 克隆毒株抗原性差异鉴定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 病毒感染性克隆的构建 |
| 4.2.2 病毒的拯救及鉴定 |
| 4.2.3 克隆毒株免疫电镜 察 |
| 4.2.4 克隆毒株基因组测序及PCR-RFLP分析 |
| 4.2.5 克隆毒株体外细胞传代毒价测定 |
| 4.2.6 克隆毒株感染细胞动力学测定 |
| 4.2.7 克隆毒株抗原性差异性分析 |
| 4.3 讨论 第五章 PCV2a/2b/2d三种基因型毒株动物感染试验 |
| 摘要 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 细胞和毒株 |
| 5.1.2 试剂及仪器 |
| 5.1.3 动物 |
| 5.1.4 动物试验设计 |
| 5.1.5 临床检查 |
| 5.1.6 试验猪PCV2抗体检测 |
| 5.1.7 PCV2病毒血症检测 |
| 5.1.8 不同组织器官PCV2量检测 |
| 5.1.9 致病性研究 |
| 5.1.10 外周血白细胞亚群变化 |
| 5.1.11 攻毒组组织病料PCV2基因组测序 |
| 5.1.12 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 临床观察 |
| 5.2.2 平均日增重(ADWG) |
| 5.2.3 病毒血症 |
| 5.2.4 PCV2抗体检测 |
| 5.2.5 荧光定量检测不同组织脏器中PCV2分布与载量 |
| 5.2.6 病理损伤 |
| 5.2.7 外周血免疫细胞亚群变化 |
| 5.2.8 攻毒组PCV2序列印证 |
| 5.3 讨论 第六章 PCV2a/2b基因型体外重组及其生物学特性研究 |
| 摘要 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 细胞和病毒 |
| 6.1.2 试剂及仪器 |
| 6.1.3 PCV2a和PCV2b不同基因型毒株共感染试验 |
| 6.1.4 重组病毒分离及鉴定 |
| 6.1.5 重组病毒感染性克隆构建 |
| 6.1.6 病毒形态学观察 |
| 6.1.7 重组病毒与其亲本毒体外复制效率比较 |
| 6.1.8 遗传进化树分析 |
| 6.1.9 抗原性分析 |
| 6.1.10 中和试验 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 PCV2重组突变毒株分离 |
| 6.2.2 重组病毒鉴定 |
| 6.2.3 重组病毒拯救及鉴定 |
| 6.2.4 形态学电镜观察 |
| 6.2.5 PCV2重组病毒体外复制效率 |
| 6.2.6 重组毒和亲本毒遗传进化分析 |
| 6.2.7 重组毒株与亲本毒抗原性差异 |
| 6.2.8 中和试验结果 |
| 6.3 讨论 第七章 PCV2a与PCV2b基因型重组毒株动物感染试验 |
| 摘要 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 细胞和毒株 |
| 7.1.2 试剂及仪器 |
| 7.1.3 动物 |
| 7.1.4 动物试验设计 |
| 7.1.5 临床检查 |
| 7.1.6 PCV2抗体检测 |
| 7.1.7 PCV2病毒血症检测 |
| 7.1.8 不同组织器官PCV2定量检测 |
| 7.1.9 致病性研究 |
| 7.1.10 外周血白细胞亚群变化 |
| 7.1.11 攻毒组病料PCV2基因组测序 |
| 7.1.12 统计分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 临床观察 |
| 7.2.2 平均日增重（ADWG） |
| 7.2.3 病毒血症检测结果 |
| 7.2.4 PCV2抗体检测 |
| 7.2.5 荧光定量检测不同组织脏器中PCV2分布与载量 |
| 7.2.6 病理损伤 |
| 7.2.7 外周血免疫细胞亚群变化 |
| 7.2.8 序列印证 |
| 7.3 讨论 第八章 PCV1与PCV2嵌合型毒株的构建及鉴定 |
| 摘要 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 细胞和毒株 |
| 8.1.2 试剂及仪器 |
| 8.1.3 重组质粒线性化和替换片段扩增 |
| 8.1.4 重组嵌合质粒构建 |
| 8.1.5 病毒基因组环化及DNA转染细胞 |
| 8.1.6 克隆毒株的拯救及免疫学鉴定 |
| 8.1.7 克隆毒株基因组测序 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 嵌合病毒重组质粒的构建 |
| 8.2.2 病毒的拯救及鉴定 |
| 8.3 讨论 第九章 全文结论 参考文献 致谢 作者简历 博士期间发表文章 |
（10）口蹄疫病毒非结构蛋白致免疫应答差异的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景、目的和意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 FMDV 分子生物学特征 |
| 1.2.2 FMDV 非结构蛋白的结构及功能 |
| 1.2.3 抗 FMDV 的固有免疫 |
| 1.2.4 抗 FMDV 的体液免疫应答 |
| 1.2.5 抗 FMDV 的细胞免疫应答 |
| 1.3 研究内容和方法 |
| 第二章 口蹄疫 MYA98/BY/2010 株重组毒株与其野生型毒株对豚鼠的免疫差异分析 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 重组毒和流行毒 TCID50和 LD50的测定 |
| 2.1.3 候选疫苗株的筛选 |
| 2.1.4 抗原量的确定、灭活疫苗的制备 |
| 2.1.5 豚鼠免疫 |
| 2.1.6 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 2.1.7 检测抗 FMDV 抗体 |
| 2.1.8 攻毒 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 细胞毒液 TCID50和 LD50测定 |
| 2.2.2 疫苗配制及安全性检测 |
| 2.2.3 外周血中 CD4+、CD8+T 淋巴细胞亚群数量变化 |
| 2.2.4 免疫豚鼠血清抗体应答 |
| 2.2.5 攻毒实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 口蹄疫 MYA98/BY/2010 株重组毒株与其野生型毒株对猪的免疫差异分析 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 疫苗和实验动物 |
| 3.1.2 主要耗材及试剂 |
| 3.1.3 仔猪免疫实验 |
| 3.1.4 CD3+、CD4+和 CD8+T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 3.1.5 抗 FMDV 抗体的测定 |
| 3.1.6 攻毒 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 外周血中 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞亚群数量变化 |
| 3.2.2 血清中抗体水平检测结果 |
| 3.2.3 攻毒实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 非结构蛋白免疫差异位点的初步定位 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂和耗材 |
| 4.1.2 差异肽段的合成 |
| 4.1.3 FMDV 致敏和外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 4.1.4 CFSE 染色 |
| 4.1.5 细胞刺激培养 |
| 4.1.6 猪体内致敏实验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、用肽ELISA区分抗FMD接种动物和康复动物（论文参考文献）
- [1]双抗体夹心ELISA检测羊肠道病毒抗原方法的建立与应用及病毒VP1蛋白抗原表位的筛选[D]. 鲁海冰. 吉林大学, 2017(01)
- [2]口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体制备、抗原位点鉴定及竞争ELISA方法的初步建立[D]. 刘华南. 新疆农业大学, 2015(06)
- [3]口蹄疫病毒非结构蛋白2C影响宿主先天性免疫的机理[D]. 郑威. 东北师范大学, 2014(01)
- [4]小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究[D]. 李继东. 中国农业科学院, 2014(10)
- [5]鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定[D]. 张琳. 山东农业大学, 2013(05)
- [6]3A与3B表位串联抗原的口蹄疫鉴别诊断ELISA的研究[D]. 王欢. 东北农业大学, 2013(10)
- [7]蓝舌病病毒16型VP2、VP5蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[D]. 王文世. 中国农业科学院, 2013(02)
- [8]树突状细胞提呈重组口蹄疫病毒结构蛋白VP1-VP4抗原的机制[D]. 安鹏丽. 河北农业大学, 2013(03)
- [9]猪圆环病毒2型不同基因型毒株的遗传变异、抗原表位及其致病性研究[D]. 郭龙军. 中国农业科学院, 2012(10)
- [10]口蹄疫病毒非结构蛋白致免疫应答差异的分析[D]. 孙英军. 中国农业科学院, 2012(10)