一、苜蓿花叶病毒复制酶(P_2亚基)基因全长cDNA植物表达载体的构建（论文文献综述）
何宛芹[1]（2021）在《凤果花叶病毒和苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用》文中提出番茄是重要的蔬果作物,而大豆是重要的蔬油兼用作物,也是人类和牲畜的优质蛋白来源。然而,番茄和大豆生产中极易感染各种植物病毒,并造成巨大的产量和经济损失。凤果花叶病毒（pepino mosaic virus,PepMV）和苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）分别是世界范围内番茄和大豆作物的重要病毒病原,严重威胁着番茄和大豆安全生产。迄今作物病毒病缺乏有效的防治药剂,而简单快速、灵敏特异、准确实用的检测技术是病毒病监测、预警和开展绿色防控的关键。为此,本研究分别创制了抗PepMV和抗AMV的特异、灵敏的单克隆抗体,并以创制的单克隆抗体为检测抗体建立了检测这两种病毒的灵敏和特异的血清学方法,为PepMV和AMV的诊断检测、流行病学研究以及科学防控提供试剂和技术支持。1.凤果花叶病毒单克隆抗体的创制及其血清学检测方法用差速离心的方法从感染PepMV的本氏烟中提取了PepMV粒子,病毒粒子作为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,利用鼠杂交瘤细胞技术创制分泌抗PepMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合、PepMV抗体选择和细胞克隆,获得6株分泌高度特异和高度灵敏的PepMV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,即15B2、8H6、23D11、20D9、3A6和8E3。这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体类型均为IgG1、kappa轻链,间接ELISA效价均达到10-7。Western blot实验分析发现,6个PepMV单克隆抗体均特异性识别PepMV的衣壳蛋白。ACP-ELISA结果显示,6个单克隆抗体均与PepMV发生特异性免疫反应,而不与番茄黄曲叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、马铃薯X病毒和健康植物发生交叉反应。以创制的单克隆抗体为检测抗体建立了检测番茄植株中PepMV的ACP-ELISA、dot-ELISA、Tissue print-ELISA和DAS-ELISA四种血清学方法。建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和DAS-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度分别达1:163,840、1:20,480和1:1,310,720倍稀释（重量/体积,g/m L）。利用建立的血清学方法对田间样本中的PepMV进行了检测分析,并用RT-PCR和DNA测序验证了4种血清学方法检测PepMV的可靠性和有效性。2.苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其血清学检测方法用差速离心的方法从感染AMV的大豆植株中提取了AMV粒子,以提纯的病毒粒子作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,利用鼠杂交瘤细胞技术创制了5株分泌AMV的高度特异和灵敏的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,即22G7、7G12、13G1、21D5和22D2。5个杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的间接ELISA效价均达到10-7。Western blot实验结果发现,5株单克隆抗体特异性地识别AMV的外壳蛋白。ACP-ELISA分析发现,5个单克隆抗体均与AMV发生特异性免疫反应,而不与大豆花叶病毒、大豆矮化病毒、黄瓜花叶病毒、李属坏死环斑病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物发生交叉反应。以创制单克隆抗体为检测抗体建立了检测大豆中AMV的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA三种血清学方法。建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度分别达1:81,920和1:20,480倍稀释（重量/体积,g/m L）。利用建立的血清学方法对田间大豆样本中的AMV进行了检测分析,并用RT-PCR和DNA测序验证了三种血清学方法检测AMV的准确性和有效性。
张静[2]（2020）在《大豆GmCBL4基因启动子和GmCBL10基因的克隆及遗传转化》文中研究指明钙调磷酸酶B亚基蛋白（calcineurin B-like protein,CBL）是一种钙结合蛋白,在植物逆境信号传导中发挥重要功能。CBL蛋白和与其相互作用的蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）是CBL/CIPK信号系统的基本要素。该信号系统在植物高盐、干旱以及低温等非生物胁迫中起着关键作用。钙离子作为植物中一种必不可少的第二信使,在植物遭受逆境胁迫通过其浓度的时空变化来传导胁迫信号,CBL蛋白能够感知逆境Ca2+信号,并与Ca2+结合,进而激活其下游蛋白激酶CIPK,并与其形成CBL-CIPK复合体,对转录因子及胁迫应答基因进行调节,调控不同细胞水平以及组织部位的抗逆性,从而帮助植物应对逆境胁迫带来的影响。驱动基因表达的启动子是转录水平调控基因表达的重要元件,对启动子结构与功能的深入研究有助于了解基因在植物生长发育与逆境防御中的作用机制,进而为有针对性的进行植物的抗逆改良提供依据。本研究从大豆中克隆GmCBL4基因启动子（CblP1）全长及其不同长度5’缺失片段,并分别构建植物表达载体,转化烟草,为启动子功能分析奠定了基础;同时克隆了大豆GmCBL10基因并转化烟草,为该基因的功能分析和利用转基因技术培育大豆抗逆品种奠定了基础。本研究的主要研究结果如下:1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL4基因上游序列设计引物,从大豆中克隆得到GmCBL4基因启动子序列,序列长度为1876bp,命名为CblP1。通过启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE预测发现,该序列中含有保守结构域TATA-box和CAAT-box,以及一些非生物胁迫应答顺式作用元件（MBS干旱诱导相关元件、LTR低温诱导相关元件）、光诱导信号转导元件、激素应答顺式作用元件以及花粉发育特异性激活元件等,预测结果表明该启动子具有逆境胁迫诱导特性。构建了该启动子驱动的植物双元表达载体pCAMBIA1301-CblP1通过农杆菌介导转化烟草,获得2株CblP1融合gus报告基因的阳性转化植株。2.为寻找该启动子的核心功能区,进一步对该启动子进行5’端缺失分析,克隆了4个不同长度的5’端缺失片段,序列长度分别为1399bp（Cbl P2）、932bp（CblP3）550bp（CblP4）和248bp（CblP5）,并分别构建5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体,分别为pCAMBIA1301-Cbl P2、pCAMBIA1301-CblP3、pCAMBIA1301-CblP4和pCAMBIA1301-CblP5,通过农杆菌介导转化烟草,获得2株CblP3融合gus报告基因的阳性植株。3.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草进行瞬时转化,经过GUS组织化学染色分析发现,全长启动子序列CblP1（1876bp）和5’缺失启动子序列CblP2（1399bp）、CblP3（932bp）具有启动活性,且CblP3启动活性最强;CblP4（550bp）和CblP5（248bp）无启动活性。推测该启动子核心功能区可能位于-932-550区域内。4.以大豆RNA反转录的cDNA为模板,从大豆中克隆获得了大豆GmCBL10基因序列,全长1049bp,其中ORF区792bp,共编码263个氨基酸。对该基因所编码蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位预测分析,发现该蛋白属于酸性、亲水性蛋白,无信号肽,含有典型的EF-hand结构域和1个跨膜结构域,主要定位于细胞质和线粒体中。系统进化分析表明,GmCBL10与菜豆中同源蛋白的亲缘关系最近。克隆带有同源重组接头的大豆GmCBL10基因CDS序列,通过同源重组的方法构建了植物表达载体pCPB-GmCBL10,冻融法转化农杆菌EHA105,叶盘法转化烟草,经PCR鉴定获得3株阳性转GmCBL10基因植株。
耿国伟[3]（2020）在《小麦黄花叶病毒不依赖帽子翻译的差异化调控研究》文中认为小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属。基因组含两条单链正义RNA,WYMV基因组的5‘端没有帽子结构,有共价结合的Vpg蛋白,3‘端有poly（A）尾;RNA1全长约7.6 kb,RNA2全长约3.6 kb,分别编码一个约270 KDa和100 KDa的多聚蛋白,经蛋白酶切割共产生10个成熟的功能蛋白,另外可能以转录水平的移码策略产生P3N-PIPO蛋白。本研究主要是解析WYMV不依赖帽子翻译调控机理,分析WYMV RNA1和RNA2的核心调控元件以及WYMV不同分离物间不依赖帽子翻译调控元件的差异化调控。首先,分别从泰安和临沂发病小麦新克隆了WYMV泰安分离物（TADWK）和临沂分离物（LYJN）的全基因组序列。WYMV不同分离物RNA的5‘UTR序列一致性较低,是突变热点区域,暗示5‘UTR在WYMV的基因表达调控中可能发挥重要作用。利用麦胚提取物的体外翻译系统和萤火虫荧光酶素（Fluc）载体,结合WYMV潢川分离物（HC）分析了实验室已有的三个分离物（TADWK、LYJN、HC）的RNA1和RNA2的5‘UTR对不依赖帽子翻译的调控作用。结果表明,3个WYMV分离物的RNA1和RNA2的5‘UTR均具有不依赖帽子翻译增强子活性。3个分离物的RNA1的5‘UTR的翻译调控效率基本一致,而3个分离物的RNA2的5‘UTR的翻译调控效率相差可达约7倍。选取WYMV潢川分离物（HC）RNA1为研究对象分析WYMV RNA1的不依赖帽子翻译调控机制。RNA1 5‘UTR具有IRES活性,且3‘UTR可协同提高5‘UTR的IRES活性3.15倍;梯度缺失实验定位了RNA1的IRES活性核心区为20-130 nt。利用In-line probing技术分析RNA1 5‘UTR的空间结构,IRES核心区主要包括2个茎环（H1和H2）和1个连接区（LR1）;比较3‘UTR加入后的RNA结构变化,初步定位了RNA1 5‘UTR和3‘UTR的潜在远距离RNA-RNA互作。利用EMSA和突变体的体外翻译分析定位了5‘UTR和3‘UTR远距离RNA-RNA互作区域是80CU和7574AG,并且该保守性的互作对于IRES的翻译效率有明显提升作用。茎环H1的茎部稳定性以及顶环3‘端区域的碱基特异性正调控IRES活性,茎环H2的茎长度和顶环5‘端区域的碱基特异性与IRES活性正相关。反式竞争实验发现,WYMV RNA1 5‘UTR的IRES元件属于eIF4E依赖型,且eIF4E结合靶标主要位于茎环H2的顶环区域,尤其是114CUUUCC。此外,In-line probing实验表明茎环H1和H2中的胞嘧啶(C55、C66、C105和C108)以及LR1中的鸟嘌呤(G73、G79和G85)处于碱基被封闭状态,通过一系列突变体的体外翻译实验,发现这4个C和3个G形成不连续的C-G碱基配对,且处于动态平衡状态。茎环H1中的胞嘧啶(C55和C66)和LR1中的鸟嘌呤(G73、G79和G85)的碱基配对正向调控IRES活性,茎环H2中的胞嘧啶(C105和C108)和LR1中的鸟嘌呤(G73、G79和G85)的碱基配对负调控IRES活性,WYMV RNA1 5‘UTR中由不连续的C-G碱基配对(C55、C66、C105、C108与G73、G79、G85)形成的稳态结构精细调控蛋白翻译水平。这是IRES元件中首次发现动态平衡状态,并且暗示WYMV RNA1的翻译进化方向是翻译水平的适量,而不是翻译最大化。由于WYMV不同分离物RNA2 5‘UTR的不依赖帽子翻译调控活性存在显着差异,利用WYMV潢川分离物（WYMV-HC）和临沂分离物（WYMV-LYJN）的RNA2进行比较研究。WYMV RNA2的5‘UTR也具有IRES活性,且3‘UTR可协同提高其IRES活性1.5倍。梯度缺失实验表明,WYMV-HC RNA2和WYMV-LYNJ RNA2的5‘UTR的IRES核心区分别位于20-150 nt和30-150 nt。In-line probing技术分析了两种WYMV分离物RNA2 5‘UTR的结构,表明WYMV-HC与WYMV-LYJN的RNA2 5‘UTR结构存在两个明显的差异区,包括第一个茎环（H1）结构的基部茎的结构稳定性和第二个茎环（H2）结构的顶环的碱基特异性;一系列的突变实验表明,这两个区域的差异是造成两个WYMV分离物RNA2的IRES活性差异的主要原因。还发现两个WYMV分离物RNA2 5‘UTR茎环H1都存在一个碱基相对保守的顶环,且这个保守的顶环在翻译过程中至关重要。反式竞争实验表明WYMV RNA2的IRES元件属于eIF4E依赖型,其中在WYMV-HC中eIF4E的结合靶标位于茎环H1的顶环,而在WYMV-LYJN中eIF4E的结合靶标位于茎环H1和茎环H2的顶环。以上结果暗示,造成WYMV-HC和WYMV-LYJN翻译的显着差异的根本原因在于其eIF4E结合位点的数目不同,导致同等条件下结合eIF4E的效率不同。通过本研究,首次完成马铃薯Y病毒科中唯一双分体病毒属（大麦黄花叶病毒属）的IRES调控机制研究,发现了WYMV RNA1 IRES的动态平衡调控模型和RNA2 IRES的差异化调控模型,丰富了植物RNA病毒的IRES研究纵深,同时为WYMV病毒病的防治提供理论依据和防治靶标。
梅琼[4]（2019）在《高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究》文中研究说明水稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）引起的一种毁灭性病害,可造成水稻大量减产。抗病品种的利用是一种经济且对环境友好的防治手段,但是其前提是需要不断挖掘新的抗白叶枯病基因资源并明确抗病基因功能。本研究利用前期诱变获得的广谱高抗白叶枯病的水稻类病变突变体hpil3开展了抗病目标基因定位、克隆,蛋白组学,目标基因的互作基因筛选等相关研究,同时对疣粒野生稻中RCA在抗白叶枯病中的作用机理进行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通过基于重测序的图位克隆策略成功定位并克隆了该突变体的目标基因。该基因定位在4号染色体的20-22Mb区域内,进一步筛选得到7个候选的基因。通过对突变位点的验证和生物信息学分析最终确定了一个可能性较大的候选基因。转基因功能互补验证结果表明,该野生型基因成功使hpil3的表型恢复为野生型并丧失了对白叶枯病的抗性,从而确证了该候选基因就是hpil3的目标基因。通过实时荧光定量PCR发现hpil3中病程相关基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表达量显着高于其野生型大粒香（DLX）,而PR9略高于DLX;未接病菌的hpil3体内的HPIL3表达量显着高于野生型,这可能是由于基因突变导致的功能丧失从而使植株提高了该基因的表达量;突变体中HPIL3的表达量受白叶枯病菌诱导表达,且接菌后该基因表达量迅速升高,分析认为该基因与水稻抗白叶枯病具有相关性。对hpil3和DLX不同叶位进行荧光差异双向凝胶电泳结合质谱分析鉴定了291个差异表达倍数≥1.5倍且t-test≤0.05的蛋白,其中74个蛋白上调,217个蛋白下调。这些蛋白功能涉及氨基酸/蛋白代谢和修饰、光合作用、核苷酸代谢、防御相关、能量代谢、糖代谢、氧化还原等。进一步的数据分析显示hpil3多种主要的代谢途径如光合作用、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、卡尔文循环相关酶的表达量大多跟hpil3类病变表型发生程度呈负相关。一些抗病相关蛋白如PR10、14-3-3蛋白上调,而负调控细胞凋亡的AAA-type ATP酶下调,同时抗氧化的酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）上调,这些结果表明hpil3植株体内产生了抗性反应,与此同时各种相关代谢途径也受到影响,为了保持细胞稳态,ROS清除系统也在发挥积极的作用。采用酵母双杂交筛选到四个hpil3目标基因的互作基因。这些互作基因经过了基因全长的酵母双杂验证。其中质体蓝素和光系统Ⅱ的23kDa多肽是叶绿体蛋白。另外两个蛋白其中一个是包含C末端结构域的YL1核蛋白和一个胁迫应答蛋白。推测hpil3目标基因的突变导致编码蛋白不能与相关蛋白互作从而介导了下游抗病信号途径的激活。接种Xoo的疣粒野生稻产生的大量H2O2可诱导叶片内RCA与类囊体膜的结合。本研究发现接种Xoo会诱导疣粒野生稻发生H2O2的迸发,且氧化迸发的时间段和RCA从叶绿体基质向类囊体膜转移的时间段高度吻合,这暗示了二者存在某种关系。H2DCFDA染色试验发现生成的H2O2积累在叶片的叶绿体。进一步体外实验表明H2O2可诱导疣粒野生稻RCA的转移,且这种转移是疣粒野生稻特异的,混合疣粒野生稻和栽培稻大粒香得叶绿体组分不会发生这种转移。综上所述,本文利用基于二代基因组测序的图位克隆策略,克隆了并通过转基因功能互补确证了hpil3的目标基因,结果表明HPIL3的突变和功能缺失导致了水稻叶片类病变表型,既HPIL3负调控水稻叶片细胞程序性死亡和类病变表型;实时荧光定量PCR研究结果表明hpil3叶片多个抗病相关基因显着上调;蛋白质组学的研究表明HPIL3通过多种途径参与调节水稻类病变的形成;进一步通过酵母双杂交筛选获得了HPIL3的4个候选互作基因;疣粒野生稻可能通过核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco activase,RCA）与类囊体膜的结合从而避免其受到激增的H2O2伤害,说明RCA除了我们通常所知的调节光合作用外也可能在疣粒野生稻抗Xoo中发挥作用。本研究为水稻抗白叶枯病机制的深入研究以及水稻抗病育种提供了重要的基因资源和前期理论基础。
李梅蓉,孙媛,卢建霖,苏荣,沈并兵,朱芹[5]（2019）在《苜蓿花叶病毒的研究进展》文中研究表明苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）是一种世界性分布病毒,其寄主范围广泛,能对多种重要经济作物和豆科牧草造成危害,给畜牧业生产和经济发展带来严重损失。为苜蓿花叶病毒病的防治及深入研究提供理论基础,从AMV的生物学特性、基因组结构、检测及防治方法等方面对其研究现状进行了综述,并对其研究方向进行了展望。
卢刚[6]（2018）在《水稻条纹病毒基因组包壳及NSvc2蛋白介导灰飞虱传毒机制研究》文中认为水稻条纹病毒（Rice stripe tenuivirus,RSV）是引起水稻条纹叶枯病的病原物,该病害在中国乃至东南亚国家多次在水稻作物上大面积爆发。早期研究已经报道该病毒的粒子形态为丝状无规则且表面无囊膜包裹结构,仅依靠核衣壳蛋白包裹病毒的基因组RNA。然而RSV病毒在寄主体内增殖包壳的生物学过程依然未知,即核衣壳蛋白如何高效的包裹病毒基因组从而不被寄主体内的核酸酶所降解。此外,RSV病毒虽已知以循回增殖方式经灰飞虱介体传播,但该病毒如何突破灰飞虱中肠屏障侵入其介体中肠上皮细胞的分子机制尚不清楚,解析这些生物学过程能给病害综合防控与治理提供强有力的理论基础。为探究这些重要的生物学问题,本研究主要围绕以下两个方面进行课题开展,现将结果简要总结如下:1.水稻条纹病毒基因组包壳机制研究水稻条纹病毒隶属于丝状多分体负义链RNA病毒,病毒粒子只由核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）和基因组RNA组成。然而,目前对于RSV粒子组装过程中NP蛋白如何与基因组RNA发生互作还不清楚。本论文利用同源建模和生化试验解析了 NP蛋白结构和功能特性。同源建模发现预测的NP蛋白结构中有一段RNA结合区域,点突变鉴定发现该区域中的极性氨基酸对于RNA结合及抵御RNA酶消化是必需的。生化试验表明NP蛋白通过自身互作可形成五聚体、六聚体、七聚体和八聚体,且每一类多聚体都能结合基因组RNA。利用预测的多聚体三维结构结合生化试验发现多聚体的形成依赖NP蛋白氨基端手臂,缺失手臂后的NP蛋白丧失多聚体形成及减弱对RNA的保护能力。本研究揭示了水稻条纹病毒在基因组包壳过程中NP蛋白结合基因组RNA的分子机制。2.NSvc2蛋白介导水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞的分子机制研究昆虫介体在传播动植物病毒过程中扮演重要角色。病毒编码的辅助因子在非循回传播过程中作为一种分子桥梁将病毒粒子结合在昆虫受体表面。然而,循回传播的病毒是否也会利用相同策略进行传播尚不清楚。本论文利用一种新的反向遗传学技术发现RSV编码的非结构蛋白NSvc2以类似辅助因子的功能介导RSV进入灰飞虱中肠细胞。虽然NSvc2蛋白不存在提纯的病毒粒子样品中,但其切割后的成熟蛋白NSvc2-N可与病毒粒子互作并通过N-糖基化位点直接结合在中肠表面。经中肠受体识别后,中肠细胞经内吞作用将病毒粒子及NSvc2胞吞进早期和晚期内含体中。晚期内含体内酸性环境诱导另一成熟蛋白NSvc2-C发生构象变化,通过NSvc2-C中高度保守的融合环基序引发膜融合进而将内含体中的RSV粒体释放到细胞质中。但是,膜融合缺陷突变体不能将病毒粒子从内含体中释放到细胞质。总之,本研究发现循回传播的植物病毒同样也编码一种类似辅助因子蛋白扮演分子桥梁的角色介导病毒粒子与昆虫中肠受体发生相互作用。
李林颖[7]（2018）在《中国小麦花叶病毒致病相关功能域（VRpep）研究及小麦黄花叶病毒siRNA在小麦不同组织中的比较分析》文中研究表明中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）和小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）是由禾谷多黏菌（Polymyxa graminisL.）传播的小麦病毒,这两种病毒侵染导致的小麦黄花叶病对我国冬小麦区小麦的安全生产造成严重危害。植物病毒编码的几乎所有蛋白均有可能是病毒的致病因子,复制酶导致的寄主致病性已在多种植物病毒中报道过。最新的研究表明寄主RNAi产生的病毒来源小干扰RNA（virus derived small interfering RNA,vsiRNA）也可能靶向寄主内源性基因,导致寄主症状的产生。本研究明确了 CWMV复制酶P153可变区的VRpep是能增强多种植物病毒致病能力的功能域（非vsiRNA）,并对其致病机理作了初步研究。同时,通过对小麦根部和叶片WYMV siRNA的分析表明小麦不同组织对土传病毒的RNA干扰（RNA interfering,RNAi）抗性机制可能存在差异。本研究的具体结果如下:1.本研究利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默对CWMV复制酶的致病性相关区域,及CWMV基因组上潜在的致病性vsiRNA进行筛选。在复制酶P153区域鉴定了一段致病相关的序列CR1-7,进一步的缺失突变和翻译提前终止明确了 CR1-7是CWMV复制酶上致病相关的结构域,非vsiRNA,且最短有效功能域长度为46个氨基酸,命名为VRpep。2.进一步的实验表明,除TRV外,VRpep还能够促进马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）在本氏烟上的侵染和复制,提高相应病毒的转录本和蛋白在本氏烟上的积累量,表明VRpep增强病毒致病的能力可能具有非特异性。3.CWMV VRpep及其同属（Furovirus）病毒同源序列具有较高保守性,属内五种病毒的VRpep同源序列均能有效增强TRV在烟草上的侵染和病毒的积累,表明VRpep功能可能具有Furovirus属特异性。另外Furovirus属中VRpep同源序列的三个连续的保守氨基酸位点（FLD）对其功能可能具有重要作用。4.CWMV VRpep和CR1-7均不具备沉默抑制子的活性,同时也不能增强TRV、PVX等其他病毒在本氏烟上的沉默抑制能力,其致病机理可能和RNAi无直接相关性。5.Pull-down筛选到本氏烟中与CWMV CR1-7具有潜在互作能力的蛋白88个,进一步的GO（Gene Ontology）分析表明筛到的寄主蛋白中有多个与植物防御途径相关,表明CR1-7（或VRpep）可能和相应寄主蛋白存在互作并抑制了寄主防御相关通路实现其致病功能。6.对小麦根和叶组织中WYMV来源的siRNA特点进行分析,结果表明小麦根和叶中的vsiRNA在丰度、基因组分布模式及5’端核苷酸偏好性等均存在明显差异,进一步分析病毒侵染后根和叶片中RNAi途径相关基因的表达情况,表明小麦对土传病毒的RNAi抗性机制在根和叶中可能存在组织特异性。CWMV和WYMV是我国土传小麦病毒病的两种病原,本研究得到的结果将有助于进一步深入研究土传病毒病和寄主互作机制,同时也为发展土传病毒病新的抗病策略提供新的思路。
张坤[8]（2017）在《大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析》文中研究说明病毒的基因组相对较小,蛋白编码能力有限,而病毒的侵染、复制、移动、致病等过程均需要一种或者几种病毒蛋白的直接参与。在寄主与病毒长期地共进化过程中,病毒蛋白逐渐进化出同时具有多种功能的特性,并参与病毒侵染循环的不同过程。大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus,BSMV）是一种ss（+）RNA病毒,基因组由α、β和γ3条RNA链组成。RNAα编码的αa蛋白具有解旋酶（HEL）和甲基转移酶（MET）结构域,是病毒的复制酶大亚基;RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和病毒的运动相关蛋白TGBs,RNAy编码的γa具有保守的GDD基序,是病毒的复制酶小亚基。γb是一个分子量为17 kDa的富含半胱氨酸的蛋白,具有致病决定因子、种传相关因子、本生烟上的系统运动决定因子和基因沉默抑制子等多种功能,但其与BSMV其它蛋白间的相互作用并协同调控病毒的复制和运动的研究尚未见报道。前人的研究表明,在BSMV侵染的条件下γb蛋白主要定位于细胞质中,部份能特异性的定位于叶绿体上,但是关于其叶绿体定位的生物学功能却是未知的。为此,利用瞬时表达、Pumilio为基础的ssRNA可视化定位系统、dsRNA可视化定位系统等,在激光共聚焦显微镜（CLSM）下观察到病毒的复制酶αa和γa、病毒的（+）RNA、复制过程中产生的（-）RNA及dsRNA复制中间体均能定位于叶绿体,通过实验证据明确了叶绿体是BSMV的主要复制位点。通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）及免疫共沉淀（Co-IP）等技术,首次证明γb蛋白与复制酶αa在体内直接互作,yb被αa招募至病毒的复制位点,互作的关键区域分别为yb蛋白的coiled-coil区（aa 86-127）和复制酶αa的甲基转移酶结构域（aa 1-834）。通过分析γb蛋白缺失或者突变后病毒的复制积累量,以及顺式或反式表达番茄丛矮病毒（TBSV）抑制子p19均不能回补由于γb蛋白的缺失或者突变造成的BSMV复制缺陷等实验,首次发现γb蛋白具有促进病毒复制的新功能,且该功能与其基因沉默抑制子的活性关系不大;通过体外dsRNA解旋酶活性等实验证明γb蛋白促进复制酶αa的解旋酶活性,且该促进作用完全依赖于其ssRNA结合活性。γb蛋白通过与复制酶αa直接互作被招募至BSMV主要复制场所叶绿体、以及作为解旋酶增强子促进病毒复制这些新功能的发现增加了我们对病毒编码的基因沉默抑制子多功能性的进一步认识。作为在本生烟上的系统运动决定因子,γb蛋白参与BSMV运动的具体形式及其调控机制并不清楚。通过分析缺失γb蛋白的BSMV突变体在本生烟和大麦上的运动效率及其致病性,证明了BSMV在不同的寄主植物的运动中对于γb蛋白的需求是不同的,即双子叶植物本生烟需要γb参与,而单子叶植物大麦上却不需要,这可能与植物的维管束组织存在差异有关;利用Y2H及BiFC证明了 γb蛋白与病毒的运动蛋白TGB2发生互作;Co-IP实验证明了 γb蛋白是病毒核糖核蛋白（Ribonucleoprotein,RNP）运动复合物的组分;最后,通过CLSM观察发现,缺失γb蛋白的病毒突变体在本生烟上表现出胞间运动受阻的现象。这些实验初步证明了 γb蛋白能与运动蛋白TGB2于微丝或内质网上互作,并可能作为病毒RNP运动复合物的组分来促进BSMV的胞间运动。γb蛋白促进BSMV复制和运动新功能的发现有助于我们深刻理解病毒编码的基因沉默抑制子和富含半胱氨酸的小病毒蛋白的多功能性。
周翠姬[9]（2017）在《BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究》文中研究表明病毒协生互作是指两种不相关的病毒复合侵染同一寄主植物,使寄主植物出现更加严重的症状或者其中一种或两种病毒的积累量增加。马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）是最具有经济重要性的植物病毒属之一,该属病毒常与幽影病毒属病毒（umbraviruses）复合侵染,引起严重的植物病害。然而,马铃薯卷叶病毒属病毒与幽影病毒属病毒协生互作的机制尚不十分清楚。本论文以马铃薯卷叶病毒属的芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）以及幽影病毒属的豌豆耳突花叶病毒2号（Pea enation mosaic virus 2,PEMV 2）为主要研究材料,对BrYV与PEMV 2在本生烟（Nicotiana bentaamiana）协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱进行研究。与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟导致:（1）本生烟植株产生严重的症状;（2）BrYV的积累量明显升高;（3）BrYV能够进行摩擦接种;（4）BrYV突破韧皮部局限。BrYV P0突变体病毒BrYV-APO和BrYV-P0H10Q/T11P并不能与PEMV 2在本生烟上协生互作。而缺失了通读结构域（Read-through domain,RTD）的BrYV病毒突变体（BrARTD）能与PEMV 2在本生烟上协生互作。通过农杆菌介导的叶盘转化方法获得了能稳定表达BrYV P0-6×Myc或PEMV 2 ORF4-3×Flag的转基因本生烟植株,为后续研究提供重要的实验材料。以上结果表明BrYV与PEMV 2在本生烟上存在协生互作并引起一系列的协同效应。转录组高通量测序结果表明与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟引起更多的基因表达发生变化,有1778个基因的表达在病毒复合侵染时发生特异性的上调或下调,这些基因主要包括光合作用相关基因、乙烯相关基因、植物防御相关基因、RNA沉默相关基因、转录因子和蛋白翻译相关基因。推测在BrYV与PEMV 2协生互作时发生特异性变化的基因为潜在的与病毒协生互作相关的寄主因子。小RNA高通量测序结果说明BrYV与PEMV 2协生互作主要对来源于BrYV病毒的小干扰RNA（Virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs）产生影响,表现为:（1）显着提高了 BrYV vsiRNAs的积累量;（2）改变了 BrYV vsiRNAs的正负义链的比例;（3）明显地改变了 BrYV vsiRNAs在BrYV基因组上的分布以及相对积累量。BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟特异性地引起14个本生烟miRNAs表达水平的变化,其中6个为显着上调,8个为显着下调。以上结果解析了病毒协生互作对病毒vsiRNAs以及寄主miRNAs的影响。同时,对Polerovirus新病毒进行了分子鉴定与序列分析。从豌豆和蚕豆样品中发现并鉴定了一种新的马铃薯卷叶病毒属病毒,暂命名为豌豆温和褪绿病毒（Pea mild chlorosis virus,PMCV）。另外,从甜菜样品中发现了甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus,BWYV）的一种新株系并获得了其全长基因组序列,该株系存在两种基因型,即BWYV-BJA和BWYV-BJB。这两种基因型全长序列一致性为93.0%,序列差异主要位于基因组的5’端区域,其它区域则相对保守。系统发育进化树分析和重组分析表明BWYV-BJA和BWYV-BJB可能是重组病毒。
李明骏[10]（2017）在《玉米AKINβγ蛋白与水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的分子互作研究》文中研究表明水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarfvirus,RBSDV）引起的玉米粗缩病是危害我国玉米生产的一种主要病害。RBSDV是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）的成员,目前关于其与玉米寄主的分子互作报道较少。本文以RBSDV副核心蛋白P8为诱饵筛选玉米茎叶cDNA文库,获得与之互作的寄主因子ZmAKINβγ蛋白,研究了 P8与ZmAKINβγ蛋白的相互作用以及ZmAKINβγ与RBSDV之间的相互影响,初步探索了 ZmAKINβγ在RBSDV侵染玉米过程中的功能以及ZmAKINβγ影响病毒侵染所参与的生理路径。利用酵母双杂交（yeast-two hybrid,Y2H）和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）实验证明了 P8与ZmAKINβy-2以及玉米中ZmAKINβγ基因另一拷贝编码蛋白ZmAKINβy-1在酵母、本生烟和玉米原生质体细胞中的互作。P8与AKINβγ蛋白的互作不具有寄主特异性,而是依赖于ZmAKINβγ蛋白N端的KIS（kinase interacting sequence）和第一个CBS（cystathionine β-synthase）保守结构域。对P8与ZmAKINβy-1/-2蛋白的亚细胞定位研究表明,P8与ZmAKINβy-1/-2均定位于本生烟细胞和玉米原生质体细胞的细胞质与细胞核中,且P8可在核仁中聚集,ZmAKINβy-1/-2与P8共表达使P8无法聚集于核仁中。而P8的表达会抑制ZmAKINβγ-1/-2作为γ亚基参与snf4Δ酵母突变体细胞糖代谢途径的功能。RBSDV侵染后不同时间点差异调控ZmAKINβγ-1/-2基因的表达。基因枪轰击介导的瞬时表达实验表明RBSDV侵染改变ZmAKINβγ-1/-2在玉米叶片中的亚细胞定位。为解析ZmAKINβγ-1/-2基因的生理功能及其在RBSDV侵染过程中的作用,用雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus,BMV）VIGS系统同时沉默ZmAKINβγ-1/-2基因,结果显示,ZmAKINβγ-1/-2的沉默会影响蔗糖和淀粉代谢途径中多个基因的表达,并提高葡萄糖和蔗糖的积累量。同时,沉默ZwAKINβγ-1/-2基因后的RBSDV挑战接种实验表明ZmAKINβγ1/-2基因的下调表达会促进RBSDV的积累,进一步发现外施葡萄糖促进RBSDV的积累。RBSDV侵染调控糖代谢途径相关基因的表达,上调葡萄糖的含量而下调蔗糖的含量。ZmAKINβγ-2以及水稻和本生烟编码的AKINβγ同源物均可诱导本生烟细胞坏死反应,但P8的表达并不影响ZmAKINβγ-2诱导细胞坏死的活性。ZmAKINβγ除可响应RBSDV的侵染,甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）或玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus,MCMV）的侵染均可调控ZmAKINβγ基因的表达,说明ZmAKINβγ基因可响应不同类型病毒的侵染。本论文的研究表明ZmAKINβγ作为普遍响应病毒侵染的寄主蛋白,在RBSDV侵染玉米过程中与P8蛋白直接互作并参与抵抗RBSDV的侵染;本文明确了 ZmAKINβγ可以参与玉米糖代谢调控,并且糖代谢路径在RBSDV与玉米互作过程中发挥重要作用。本研究有助于揭示玉米寄主抵御RBSDV侵染的抗病机制,对于玉米抗粗缩病基因的挖掘和抗病玉米种质的创制可能具有重要的参考价值。
二、苜蓿花叶病毒复制酶(P_2亚基)基因全长cDNA植物表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苜蓿花叶病毒复制酶(P_2亚基)基因全长cDNA植物表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）凤果花叶病毒和苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 凤果花叶病毒的研究进展 |
| 1.1 寄主范围、危害症状及传播方式 |
| 1.2 病毒形态及病毒基因组结构 |
| 1.3 凤果花叶病毒的检测技术 |
| 1.3.1 田间诊断 |
| 1.3.2 电镜观察 |
| 1.3.3 分子生物学检测 |
| 1.3.4 血清学方法 |
| 1.4 防治策略 |
| 1.4.1 加强田间管理 |
| 1.4.2 交叉保护 |
| 1.4.3 选育抗病品种 |
| 2 苜蓿花叶病毒的研究进展 |
| 2.1 寄主范围、病害症状 |
| 2.2 传播方式和病害流行 |
| 2.3 病毒形态及基因组结构 |
| 2.4 苜蓿花叶病毒的检测技术 |
| 2.4.1 分子生物学检测技术 |
| 2.4.2 血清学方法 |
| 2.5 防治策略 |
| 2.5.1 种子处理与加强田间管理 |
| 2.5.2 防控蚜虫 |
| 2.5.3 选育抗病品种 |
| 3 单克隆抗体技术及其在植物病毒检测中的应用 |
| 3.1 单克隆抗体的建立及应用 |
| 3.2 单克隆抗体的结构及分类 |
| 3.3 杂交瘤细胞技术的基本原理 |
| 3.4 单克隆抗体在植物病毒检测中的应用 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 凤果花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料、田间样品和试剂 |
| 1.2 提纯PepMV粒子 |
| 1.3 单克隆抗体的制备 |
| 1.3.1 免疫小鼠 |
| 1.3.2 细胞融合与培养 |
| 1.3.3 杂交瘤细胞的筛选及细胞克隆 |
| 1.3.4 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 1.3.5 腹水的制备及纯化 |
| 1.3.6 单克隆抗体的类型及亚类鉴定和效价测定 |
| 1.4 PepMV单抗的Western blot分析 |
| 1.5 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.5.1 ACP-ELISA方法的步骤 |
| 1.5.2 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 1.5.3 ACP-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.6 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.6.1 dot-ELISA方法的步骤 |
| 1.6.2 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 1.6.3 检测PepMV的dot-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.6.4 检测PepMV的dot-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.7 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.7.1 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的步骤 |
| 1.7.2 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 1.7.3 检测PepMV的Tissue print-ELISA的特异性分析 |
| 1.7.4 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.8 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.8.1 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立 |
| 1.8.2 检测PepMV的DAS-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.8.3 检测PepMV的DAS-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.9 检测PepMV的RT-PCR方法 |
| 1.9.1 Trizol法提取植物总RNA |
| 1.9.2 RT-PCR |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 PepMV粒子的提纯 |
| 2.2 杂交瘤细胞的筛选和克隆 |
| 2.3 抗体制备、效价测定及抗体类型和亚类鉴定 |
| 2.4 Western bolt分析PepMV单抗的特异性 |
| 2.5 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 检测PepMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.2 ACP-ELISA方法分析PepMV单抗的特异性 |
| 2.5.3 ACP-ELISA方法分析PepMV单抗的灵敏度 |
| 2.6 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.1 检测PepMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.2 检测PepMV的dot-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.6.3 检测PepMV的dot-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.7 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.1 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.2 检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.8 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立 |
| 2.8.1 检测PepMV的DAS-ELISA方法的建立 |
| 2.8.2 检测PepMV的DAS-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.8.3 检测PepMV的DAS-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.9 检测PepMV的血清学方法在田间样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 第三章 苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料、田间样品和试剂 |
| 1.2 苜蓿花叶病毒粒子的提纯 |
| 1.3 单克隆抗体的制备 |
| 1.3.1 免疫小鼠 |
| 1.3.2 细胞融合与培养 |
| 1.3.3 杂交瘤细胞的筛选及细胞克隆 |
| 1.3.4 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 1.3.5 单抗腹水的制备及纯化 |
| 1.3.6 单克隆抗体的类型及亚类鉴定和效价测定 |
| 1.4 Western blot分析AMV单抗的特异性 |
| 1.5 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.5.1 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 1.5.2 检测AMV的ACP-ELISA方法的特异性和灵敏度分析 |
| 1.5.3 检测AMV的ACP-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.6 检测AMV的dot-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.6.1 检测AMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 1.6.2 检测AMV的dot-ELISA的特异性和灵敏度分析 |
| 1.6.3 检测AMV的dot-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.7 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立及其特性分析 |
| 1.7.1 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 1.7.2 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析 |
| 1.7.3 检测AMV的Tissue print-ELISA方法在田间样品检测中的应用 |
| 1.8 检测AMV的RT-PCR方法 |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 苜蓿花叶病毒粒子的提纯 |
| 2.2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆 |
| 2.3 抗体制备、效价测定及亚类鉴定 |
| 2.4 Western blot分析AMV单抗的特异性 |
| 2.5 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.1 检测AMV的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.5.2 检测AMV的ACP-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.5.3 检测AMV的ACP-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.6 检测AMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.1 检测AMV的dot-ELISA方法的建立 |
| 2.6.2 检测AMV的dot-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.6.3 检测AMV的dot-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.7 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.1 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 2.7.2 检测AMV的Tissue print-ELISA方法的特异性分析 |
| 2.8 血清学方法在田间样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 4 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录A 常用生化与分子生物学试剂及仪器 |
| 附录B 常用缓冲液和培养基配方 |
（2）大豆GmCBL4基因启动子和GmCBL10基因的克隆及遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物基因启动子概述 |
| 1.1.1 植物基因启动子的结构 |
| 1.1.2 植物基因启动子的分类 |
| 1.2 植物基因启动子的研究方法 |
| 1.2.1 植物基因启动子的克隆方法 |
| 1.2.2 植物基因启动子的生物信息学分析 |
| 1.2.3 植物基因启动子的表达方法 |
| 1.3 植物CBL基因家族研究进展 |
| 1.3.1 CBL基因的蛋白结构 |
| 1.3.2 CIPK的蛋白结构 |
| 1.3.3 CBL与 CIPK作用机制 |
| 1.3.4 CBL的功能 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL4基因启动子全长序列的克隆及植物表达载体构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 GmCBL4基因启动子全长序列的克隆及生物信息学分析 |
| 2.2.3 GmCBL4基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 GmCBL4基因启动子全长序列生物信息学分析 |
| 2.3.2 GmCBL4基因启动子全长序列的克隆 |
| 2.3.3 GmCBL4基因全长启动子植物表达载体构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 大豆GmCBL4基因启动子5’缺失片段的克隆及植物表达载体构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 GmCBL4基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.2.3 GmCBL4基因5’缺失启动子植物表达的载体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GmCBL4基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.3.2 GmCBL4基因5’缺失启动子植物表达的载体 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 大豆GmCBL4基因启动子全长及5’缺失片段对烟草的遗传转化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 重组植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 4.2.3 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 4.2.4 农杆菌介导的烟草瞬时转化 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.3.2 转基因植株的鉴定 |
| 4.3.3 GUS组织化学染色分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 大豆GmCBL10基因的克隆及遗传转化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 菌种与质粒 |
| 5.2.3 实验仪器及试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 大豆cDNA的获取 |
| 5.3.2 大豆GmCBL10基因的克隆 |
| 5.3.4 序列分析 |
| 5.3.5 构建pCPB-GmCBL10 植物表达载体 |
| 5.3.6 重组植物表达载体pCPB-GmCBL10 转化农杆菌EHA105 |
| 5.3.7 烟草的遗传转化 |
| 5.3.8 转基因烟草的鉴定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 大豆GmCBL10基因的克隆 |
| 5.4.2 大豆GmCBL10蛋白的生物信息学分析 |
| 5.4.3 pCPB-GmCBL10 植物表达载体的构建 |
| 5.4.4 烟草的遗传转化 |
| 5.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）小麦黄花叶病毒不依赖帽子翻译的差异化调控研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 真核生物mRNA依赖帽子的翻译 |
| 1.1.1 翻译的起始 |
| 1.1.2 翻译的延伸 |
| 1.1.3 翻译的终止 |
| 1.1.4 核糖体的再循环 |
| 1.2 不依赖帽子翻译 |
| 1.2.1 5'端核糖体内部进入位点(5'IRES) |
| 1.2.1.1 动物RNA病毒的IRES元件 |
| 1.2.1.2 植物RNA病毒的IRES元件 |
| 1.2.1.3 细胞mRNA的IRES元件 |
| 1.2.2 3'端不依赖帽子翻译增强子(3'CITE) |
| 1.2.2.1 类大麦黄矮病毒的翻译调控元件(BTE) |
| 1.2.2.2 翻译增强子域(TED) |
| 1.2.2.3 类黍花叶病毒的翻译调控元件(PTE) |
| 1.2.2.4 “I”型结构(ISS) |
| 1.2.2.5 “Y”型结构(YSS) |
| 1.2.2.6 “T”型结构(TSS) |
| 1.2.2.7 类新疆南瓜蚜传黄化病毒的翻译调控元件(CXTE) |
| 1.3 小麦黄花叶病毒 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 质粒载体和菌株 |
| 2.1.2 实验所用主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 引物和质粒 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2 RT-PCR体系 |
| 2.2.3 cDNA末端快速扩增技术 |
| 2.2.3.1 cDNA 5'末端快速扩增(5'RACE) |
| 2.2.3.2 cDNA 3'末端快速扩增(3'RACE) |
| 2.2.4 重叠PCR |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.7 核酸的胶回收 |
| 2.2.8 连接反应 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞(DH5α或Rosetta)制备 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞(DH5α或Rosetta)转化 |
| 2.2.11 菌落PCR |
| 2.2.12 碱裂解法提质粒 |
| 2.2.13 常规体外转录 |
| 2.2.14 5'端加帽的体外转录 |
| 2.2.15 体外翻译 |
| 2.2.16 体外RNA结构分析技术—In-line probing |
| 2.2.16.1 RNA 5'末端的磷酸化同位素标记 |
| 2.2.16.2 RNA片段同位素标记后的纯化 |
| 2.2.16.3 In-line probing反应 |
| 2.2.17 EMSA |
| 2.2.18 原核表达及纯化 |
| 2.2.18.1 原核表达 |
| 2.2.18.2 原核表达蛋白可溶性检测 |
| 2.2.18.3 可溶性蛋白亲和层析(MBP标签) |
| 2.2.18.4 蛋白切胶纯化 |
| 2.2.19 体外复制 |
| 2.2.20 Northern Blot |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 WYMV不同分离物RNA1和RNA2的5'UTR调控不依赖帽子翻译 |
| 3.1.1 WYMV不同分离物RNA1和RNA2的核苷酸序列比对 |
| 3.1.2 WYMV不同分离物RNA1和RNA2的5'UTR对翻译的调控 |
| 3.2 WYMV RNA1的不依赖帽子翻译调控机理 |
| 3.2.1 WYMV RNA1 UTR对翻译的调控 |
| 3.2.2 WYMV RNA1中调控翻译的远距离RNA-RNA互作 |
| 3.2.2.1 WYMV RNA1中远距离RNA-RNA互作在5'UTR的定位 |
| 3.2.2.2 WYMV RNA1中远距离RNA-RNA互作在3'UTR的定位 |
| 3.2.3 WYMV RNAI 5'UTR IRES元件二级结构特征 |
| 3.2.3.1 WYMV RNA1 5'UTR中茎环H1的调控作用 |
| 3.2.3.2 WYMV RNA1 5'UTR中茎环H2的调控作用 |
| 3.2.4 WYMV RNA1 5'UTR IRES元件与eIF4E的关系 |
| 3.2.5 WYMV RNAI 5'UTR IRES元件三级结构特征 |
| 3.2.6 WYMV RNA1 5'UTR IRES元件动态结构模型 |
| 3.3 WYMV RNA2不依赖帽子翻译差异化调控机理 |
| 3.3.1 WYMV不同分离物RNA2 UTR对翻译的调控作用 |
| 3.3.2 WYMV不同分离物RNA2 5'UTR结构及核心元件分析 |
| 3.3.2.1 WYMV不同分离物RNA2 5'UTR差异性结构突变分析 |
| 3.3.2.2 WYMV不同分离物RNA2 5'UTR共有结构突变分析 |
| 3.3.3 WYMV不同分离物RNA2 5'UTR IRES元件与eIF4E的关系 |
| 3.3.4 WYMV不同分离物RNA2 5'UTR IRES元件结构模型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 WYMV RNA1 5'UTR的IRES具有三级动态平衡结构 |
| 4.2 WYMV RNA1中的IRES平衡状态与单个宿主中WYMV的局部适应之间的潜在关系 |
| 4.3 WYMV RNA中的IRES元件之间以及WYMV不同分离物RNA2 IRES元件之间差异性调控 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录1: poly(A)长度变化对WYMV体外翻译和复制的影响 |
| 附录2 |
| 附表3 WYMV-TADWK 和 WYMV-LYJN 与其它 WYMV 分离物之间的核苷酸序列比对(%) |
（4）高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 水稻抗白叶枯病研究进展 |
| 1.1 水稻白叶枯病 |
| 1.1.1 水稻白叶枯病概述 |
| 1.1.2 水稻抗白叶枯病基因的挖掘和功能研究 |
| 1.2 细胞程序性死亡和类病变突变体 |
| 1.2.1 细胞程序性死亡 |
| 1.2.2 水稻类病变突变体及其在水稻抗病性中的研究 |
| 1.3 疣粒野生稻对白叶枯病的抗性研究及利用 |
| 1.4 Rubisco活化酶的研究进展 |
| 1.5 病程相关蛋白 |
| 1.6 蛋白质组学及其在水稻抗病研究中的应用 |
| 1.7 酵母双杂交及其在水稻抗病研究中的应用 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 hpil3 目标基因的定位、克隆和转基因功能互补验证 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 CTAB法大量提取水稻基因组DNA |
| 2.2.2 候选基因的克隆和表达载体的构建 |
| 2.2.3 转基因水稻植株的鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 hpil3 的表型及抗性鉴定 |
| 2.3.2 hpil3 目标基因的定位和候选目标基因的筛选 |
| 2.3.3 hpil3 候选目标基因的克隆和超表达载体的构建 |
| 2.3.4 hpil3 目标基因超表达植株的转化 |
| 2.3.5 hpil3 转基因植株的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HPIL3 和抗病相关基因的表达及蛋白组学分析 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 接种白叶枯病菌后不同时间目标基因的表达量变化 |
| 3.2.2 hpil3和DLX病程相关基因的表达 |
| 3.2.3 水稻叶片总蛋白的提取 |
| 3.2.4 总蛋白的裂解 |
| 3.2.5 总蛋白的纯化 |
| 3.2.6 总蛋白的定量 |
| 3.2.7 荧光标记 |
| 3.2.8 荧光差异双向凝胶电泳 |
| 3.2.9 凝胶扫描和图像分析 |
| 3.2.10 考马斯亮蓝凝胶制备 |
| 3.2.11 差异表达蛋白质谱鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 RT-qPCR分析HPIL3的表达 |
| 3.3.2 RT-qPCR分析病程相关蛋白表达 |
| 3.3.3 hpil3 的蛋白组学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 HPIL3 的互作基因筛选 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 Trizol法提取样品RNA并检测 |
| 4.2.2 cDNA的 frist strand合成 |
| 4.2.3 LD-PCR合成ds-cDNA |
| 4.2.4 构建诱饵载体和猎物载体 |
| 4.2.5 试剂盒和碱法大量抽提质粒 |
| 4.2.6 酵母感受态细胞的制备 |
| 4.2.7 酵母自激活 |
| 4.2.8 ds cDNA和 Sma? 酶切后的PGADT7-Rec共转酵母感受态细胞 |
| 4.2.9 酵母质粒的提取 |
| 4.2.10 互作基因的酵母双杂验证 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 HPIL3 的克隆和筛库相关载体构建 |
| 4.3.2 酵母双杂交的建库 |
| 4.3.3 HPIL3 的自激活检测 |
| 4.3.4 酵母双杂筛库结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 疣粒野生稻对白叶枯病的抗性机制研究 |
| 5.1 试验材料与试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 疣粒野生稻对Xoo的抗性鉴定 |
| 5.2.2 叶绿体的提取和分离 |
| 5.2.3 SDS-PAGE和免疫分析 |
| 5.2.4 叶片提取物中H_2O_2 含量的测定 |
| 5.2.5 H_2O_2 的亚细胞定位 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 疣粒野生稻对Xoo的抗性鉴定 |
| 5.3.2 H_2O_2 含量测定、亚细胞定位及其对RCA的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）苜蓿花叶病毒的研究进展（论文提纲范文）
| 1 生物学特性 |
| 1.1 寄主症状及危害 |
| 1.2 传播介体及方式 |
| 1.3 发病条件及流行规律 |
| 2 基因组结构 |
| 3 检测方法 |
| 4 防治方法 |
| 4.1 加强田间管理 |
| 4.2 传播介体防控 |
| 4.3 抗病育种 |
| 5 结语 |
（6）水稻条纹病毒基因组包壳及NSvc2蛋白介导灰飞虱传毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻条纹叶枯病的概述 |
| 1.1 水稻条纹病毒的分布范围与田间危害 |
| 1.2 水稻条纹病毒的生物学特性 |
| 1.2.1 水稻条纹病毒粒子形态 |
| 1.2.2 水稻条纹病毒基因组结构 |
| 1.2.3 水稻条纹病毒编码的蛋白及其生物学功能 |
| 2 病毒基因组的包壳过程 |
| 2.1 病毒基因组的三种包壳方式 |
| 2.1.1 螺旋形包壳 |
| 2.1.2 二十面体包壳 |
| 2.1.3 依赖支架搭建的二十面体包壳 |
| 2.2 病毒包壳的起始信号 |
| 2.3 病毒的选择性包壳机制 |
| 2.3.1 外壳蛋白基序参与选择性包装 |
| 2.3.2 基因组RNA序列参与选择性包装 |
| 2.4 病毒的包壳和组装场所 |
| 3 昆虫介导植物病毒传播机制 |
| 3.1 昆虫传播病毒的方式 |
| 3.1.1 非持久性传播 |
| 3.1.2 半持久性传播 |
| 3.1.3 循回非增殖性传播 |
| 3.1.4 循回增殖性传播 |
| 3.2 病毒编码的关键蛋白决定昆虫传播方式 |
| 3.2.1 外壳蛋白策略 |
| 3.2.2 辅助蛋白策略 |
| 3.2.3 糖蛋白策略 |
| 3.3 昆虫体内寄主因子参与病毒传播 |
| 3.4 植物病毒改变昆虫取食行为 |
| 第二章 水稻条纹病毒基因组包壳机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒源采集与保存 |
| 1.2 摩擦接种病毒 |
| 1.3 病毒RNA提取与反转录 |
| 1.4 PCR扩增与回收 |
| 1.5 酶切与连接 |
| 1.6 连接产物转化、阳性克隆筛选与质粒抽提测序 |
| 1.7 蛋白原核表达 |
| 1.8 Western blotting分析 |
| 1.9 蛋白多聚体分析 |
| 1.10 RNA体外转录与标记试验 |
| 1.11 凝胶阻滞试验 |
| 1.12 蛋白同源建模预测与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水稻条纹病毒核衣壳蛋白可结合基因组RNA |
| 2.2 鉴定水稻条纹病毒核衣壳蛋白中与RNA结合的氨基酸位点 |
| 2.3 水稻条纹病毒核衣壳蛋白保护基因组RNA不被RNA酶降解 |
| 2.4 水稻条纹病毒核衣壳蛋白能自身互作形成不同多聚体 |
| 2.5 水稻条纹病毒核衣壳蛋白每一类型多聚体都可结合单链RNA |
| 2.6 构建水稻条纹病毒核衣壳蛋白五聚体同源模型结构 |
| 2.7 缺失氨基端手臂的水稻条纹病毒核衣壳蛋白丧失多聚体结构且与RNA结合和保护能力减弱 |
| 3 讨论 |
| 第三章 NSvc2蛋白介导水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒源采集与灰飞虱饲养 |
| 1.2 PCR扩增与回收 |
| 1.3 酶切与连接 |
| 1.4 连接产物转化、阳性克隆筛选与质粒抽提测序 |
| 1.5 水稻条纹病毒粒子提取试验 |
| 1.6 灰飞虱中肠免疫荧光标记试验 |
| 1.7 重组杆状病毒表达系统 |
| 1.8 纯化昆虫细胞表达的可溶性蛋白 |
| 1.9 Western blotting分析 |
| 1.10 蛋白糖基化分析 |
| 1.11 蛋白在灰飞虱体内结合试验 |
| 1.12 预饲喂蛋白抑制昆虫带毒试验 |
| 1.13 酵母双杂交试验 |
| 1.14 昆虫细胞低酸诱导膜融合试验 |
| 1.15 蛋白同源建模预测与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NSvc2蛋白参与水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞过程 |
| 2.2 NSvc2蛋白对于水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞至关重要 |
| 2.3 Sf9昆虫重组表达的NSvc2-N可溶性蛋白直接结合灰飞虱中肠并随后抑制灰飞虱带毒 |
| 2.4 NSvc2-N蛋白N-糖基化修饰对于灰飞虱中肠受体识别水稻条纹病毒是必需的 |
| 2.5 灰飞虱中肠细胞发生内吞作用促使RSV:NSvc2复合体进入内含体且随后释放的RSV:NSvc2-N复合体与NSvc2-C发生分离 |
| 2.6 水稻条纹病毒NSvc2-C蛋白在酸性条件下诱导Sf9细胞膜融合 |
| 2.7 保守疏水融合环基序有助于NSvc2-C蛋白的融合活性 |
| 2.8 NSvc2-C膜融合突变体不能介导水稻条纹病毒从内含体中释放 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 全文总结 |
| 1.1 水稻条纹病毒核衣壳蛋白与基因组互作包壳机制研究 |
| 1.2 NSvc2蛋白介导水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞的分子机制研究 |
| 2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）中国小麦花叶病毒致病相关功能域（VRpep）研究及小麦黄花叶病毒siRNA在小麦不同组织中的比较分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 土传小麦病毒病 |
| 1.1.1 土传小麦病毒病的危害 |
| 1.1.2 禾谷多黏菌传播的麦类病毒 |
| 1.2 植物抗病毒机制 |
| 1.2.1 植物先天免疫系统应对病毒侵染 |
| 1.2.2 抗病毒RNA沉默及其在植物与病毒相互作用中的作用 |
| 1.3 病毒突破寄主防卫的机制 |
| 1.3.1 病毒编码的沉默抑制子 |
| 1.3.2 病毒复制相关蛋白的对病毒致病能力有重要作用 |
| 1.3.3 病毒编码的其他蛋白的对病毒致病性的影响 |
| 1.3.4 vsiRNA的致病性 |
| 1.4 TRV介导的RNA沉默的应用 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 CWMV致病因子的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物Total RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录合成cDNA第一链 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 目的基因的扩增 |
| 2.2.5 克隆载体的构建 |
| 2.2.6 沉默载体构建 |
| 2.2.7 CWMV不同地区分离物中CW1-7的功能分析 |
| 2.2.8 潜在致病因子(CW1-7)的缺失突变 |
| 2.2.9 潜在致病因子(CW1-7)的移码突变 |
| 2.2.10 CW1-7 P2翻译提前终止 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 CWMV复制酶上具有致病因子序列 |
| 2.3.2 CWMV不同地区分离物中CW1-7 (CR1-7)的对病毒致病性的影响 |
| 2.3.3 CR1-7是CWMV上致病相关的功能域 |
| 2.3.4 CR1-7最短有效功能域VRpep的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VRpep功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验菌株与载体 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 农杆菌浸润烟草 |
| 3.2.3 TRV,PVX侵染转基因烟草致病性 |
| 3.2.4 TMV侵染转基因烟草致病性 |
| 3.2.5 荧光定量PCR (RT-qPCR) |
| 3.2.6 Western blot |
| 3.2.7 Furovirus属内病毒的VRpep同源序列比对 |
| 3.2.8 VRpep保守氨基酸位点突变 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 VRpep有助于TRV及PVX在本氏烟上的侵染 |
| 3.3.2 VRpep过表达转基因烟草对TRV及PVX的侵染的影响 |
| 3.3.3 VRpep过表达转基因烟草植株对TMV的侵染的影响 |
| 3.3.4 VRpep同源序列比对 |
| 3.3.6 Furovirus属内病毒的VRpep同源物均能增强TRV在烟草上的侵染 |
| 3.3.7 VRpep中三个连续的保守氨基酸(FLD)位点对其功能可能具有重要作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 VRpep致病机理初步研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验菌株与载体 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 表达载体构建 |
| 4.2.2 VRpep沉默抑制活性验证 |
| 4.2.3 Western blot |
| 4.2.4 CR1-7融合蛋白的诱导表达及与CR1-7互作蛋白的质谱分析与检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 VRpep不具沉默抑制子活性 |
| 4.3.2 烟草中与CR1-7潜在互作蛋白的质谱鉴定与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 WYMV siRNAs在小麦根和叶片中分布具有组织特异性 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 生物信息学相关软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 植物Total RNA的提取及cDNA第一链的反转录 |
| 5.3.2 PCR检测 |
| 5.3.3 样品收集,小RNA高通量测序及生信分析 |
| 5.3.4 RT-qPCR |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 小麦根中的WYMV siRNA丰度明显高于叶片 |
| 5.4.2 叶和根中的vsiRNA在病毒基因组上具有不同的分布模式 |
| 5.4.3 相对于根部,叶组织的vsiRNAs的5’末端核苷酸具有明显的A/U偏好性 |
| 5.4.4 WYMV侵染对小麦根和叶中siRNA通路相关基因的表达有不同影响 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 病毒编码蛋白的相互作用及其多功能性 |
| 1.2 正义单链RNA病毒的复制及其调控 |
| 1.3 大麦条纹花叶病毒的研究概述 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 多功能蛋白γb在BSMV复制中的新功能解析 |
| 3.1 叶绿体是BSMV的主要复制场所 |
| 3.2 γb蛋白能定位于BSMV的复制场所 |
| 3.3 γb蛋白与BSMV的复制酶αa直接互作 |
| 3.4 γb与αa蛋白互作的关键区域 |
| 3.5 γb蛋白的抑制子功能对BSMV复制的影响有限 |
| 3.6 γb蛋白显着的影响BSMV RNAα的复制水平 |
| 3.7 γb蛋白通过直接增强αa解旋酶活性来促进BSMV的复制 |
| 3.8 γb蛋白促进BSMV复制的工作模型 |
| 3.9 小结与讨论 |
| 第四章多功能蛋白γb在BSMV运动中的新功能解析 |
| 4.1 γb蛋白对于BSMV在本生烟上的系统运动是必需的 |
| 4.2 γb蛋白对于BSMV在大麦上的系统运动不是必需的 |
| 4.3 γb蛋白与TGB2蛋白直接互作 |
| 4.4 γb蛋白是BSMV的RNP复合物的组分 |
| 4.5 γb蛋白与TGB2蛋白互作区的确定 |
| 4.6 γb蛋白的突变能减弱病毒的胞间运动 |
| 4.7 γb蛋白组成的RNP运动复合物可能沿着微丝结构运动 |
| 4.8 γb蛋白促进BSMV运动可能的工作模型 |
| 4.9 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ BSMV RNAβ及RNAγ-gfp转基因本生烟的培育 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 引物与质粒列表 |
| 个人简历 |
（9）BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物病原间协生互作的研究进展 |
| 1.2 植物病毒与病毒互作 |
| 1.3 病毒协生互作产生的影响 |
| 1.4 参与病毒协生互作的病毒因子 |
| 1.5 利用演化博弈论研究病毒协生 |
| 1.6 马铃薯卷叶病毒属病毒及其韧皮部局限特性 |
| 1.7 幽影病毒属病毒简介 |
| 1.8 黄症病毒科病毒与幽影病毒属病毒互作的研究进展 |
| 1.9 马铃薯卷叶病毒属病毒的分类研究概况 |
| 1.10 本论文研究意义与目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 溶液及培养基的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 BrYV与PEMV 2协生互作的生物学特征 |
| 3.1 BrYV与PEMV2在本生烟中存在协生互作 |
| 3.2 PEMV 2能使BrYV进行摩擦接种 |
| 3.3 BrYV与PEMV-2复合侵染时能突破韧皮部局限 |
| 3.4 探索BrYV病毒中参与BrYV与PEMV 2协生互作的蛋白 |
| 3.5 P0~(Br)、ORF3~(PE)和ORF4~(PE)转基因本生烟的培育 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第四章 BrYV与PEMV 2协生互作所引起的植物转录组变化特征分析 |
| 4.1 样品采集与转录组测序 |
| 4.2 差异表达基因的鉴定 |
| 4.3 差异表达基因的GO分析 |
| 4.4 差异表达基因的KEGG分析 |
| 4.5 光合作用相关基因的变化 |
| 4.6 乙烯相关基因的变化 |
| 4.7 植物防御相关基因的变化 |
| 4.8 RNA沉默相关基因的变化 |
| 4.9 转录因子的变化 |
| 4.10 蛋白翻译相关基因的变化 |
| 4.11 RT-qPCR验证转录组测序结果 |
| 4.12 本章小结与讨论 |
| 第五章 BrYV与PEMV 2协生互作引起siRNAs的变化特征 |
| 5.1 BrYV与PEMV 2协生互作时病毒siRNAs的特征 |
| 5.2 BrYV与PEMV 2协生互作时miRNAs的变化特征 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.1 一种侵染豆科作物的Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.2 甜菜西方黄化病毒北京株系的分子鉴定与序列分析 |
| 6.3 本章小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 联合培养期间的主要研究工作 |
| 附录Ⅱ 载体构建和检测所用引物 |
| 附录Ⅲ 病毒vsiRNA杂交所用引物 |
| 附录Ⅳ RT-qPCR相关引物 |
| 个人简历 |
（10）玉米AKINβγ蛋白与水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的分子互作研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病发生概况 |
| 1.1.1 玉米粗缩病发生概况 |
| 1.1.2 玉米粗缩病的病害症状和病原 |
| 1.1.3 水稻黑条矮缩病发生概况 |
| 1.1.4 水稻黑条矮缩病的症状及病原 |
| 1.2 水稻黑条矮缩病毒研究概述 |
| 1.2.1 水稻黑条矮缩病毒的分类地位 |
| 1.2.2 RBSDV的传播 |
| 1.2.3 RBSDV病毒粒体和基因组特征 |
| 1.2.4 RBSDV编码蛋白的功能研究 |
| 1.2.5 RBSDV P8蛋白的功能研究 |
| 1.2.6 Reoviridae病毒副核心蛋白研究进展 |
| 1.2.7 RBSDV与寄主植物的相互作用 |
| 1.3 AKINβγ蛋白研究进展 |
| 1.3.1 SNF1/AMPK/SnRK1蛋白激酶复合体的构成 |
| 1.3.2 SNF1/AMPK/SnRK1蛋白激酶复合体的功能研究 |
| 1.3.3 SNF4、AMPKγ、AKINβγ蛋白的功能保守性 |
| 1.3.4 SNF4蛋白的功能 |
| 1.3.5 AMPKy蛋白的功能 |
| 1.3.6 植物中AKINγ蛋白的功能 |
| 1.3.7 植物中AKINβγ蛋白的功能 |
| 1.4 植物糖代谢 |
| 1.4.1 植物中的糖代谢途径 |
| 1.4.2 糖代谢调控植物生长和发育 |
| 1.4.3 植物糖代谢响应病原物侵染 |
| 1.4.4 植物糖代谢响应病毒侵染 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、载体和菌种 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 酶和生化试剂 |
| 2.2 常用溶液、试剂和培养基的配置 |
| 2.3 基本实验方法 |
| 2.3.1 RBSDV接种 |
| 2.3.2 植物总RNA的提取 |
| 2.3.3 去除总RNA中的基因组DNA |
| 2.3.4 RNA的纯化 |
| 2.3.5 反转录反应 |
| 2.3.6 PCR反应 |
| 2.3.7 PCR或酶切产物直接或切胶回收 |
| 2.3.8 酶切和连接反应 |
| 2.3.9 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化 |
| 2.3.10 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.3.11 农杆菌浸润法瞬时表达目的蛋白 |
| 2.3.12 酵母双杂交(yeast-two hybrid,Y2H)筛选玉米cDNA文库及回转验证 |
| 2.3.13 酵母互补实验 |
| 2.3.14 玉米原生质体制备与转化 |
| 2.3.15 基因枪轰击玉米叶片瞬时表达蛋白 |
| 2.3.16 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.3.17 Western blotting分析 |
| 2.3.18 BMV VIGS沉默玉米寄主基因 |
| 2.3.19 可溶性糖含量的测定 |
| 2.3.20 淀粉含量的测定 |
| 第三章 与RBSDV P8蛋白互作的寄主因子筛选 |
| 3.1 RBSDV侵染玉米后的症状发生 |
| 3.1.1 RBSDV接种玉米自交系Va35 |
| 3.1.2 RBSDV接种玉米后的症状发生情况 |
| 3.2 与RBSDV P8蛋白互作的玉米寄主因子筛选 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 P8蛋白的自激活检测 |
| 3.2.3 筛选玉米中与P8互作的寄主蛋白 |
| 3.2.4 ZmAKINβγ-2蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.5 小结与讨论 |
| 第四章 P8与ZmAKINβγ的互作分析 |
| 4.1 BiFC验证P8与ZmAKINβγ-2的互作 |
| 4.1.1 载体构建 |
| 4.1.2 BiFC验证P8与ZmAKINβγ-2在本生烟细胞中互作 |
| 4.1.3 BiFC验证P8与ZmAKINβγ-2在玉米原生质体细胞中互作 |
| 4.2 ZmAKINβγ-2与P8互作的关键结构域鉴定 |
| 4.2.1 ZmAKINβγ-2的结构域分析及载体构建 |
| 4.2.2 Y2H分析ZmAKINβγ-2与P8互作的关键结构域 |
| 4.3 P8与ZmAKINβγ-2互作的关键结构域 |
| 4.3.1 P8的结构域分析及载体构建 |
| 4.3.2 Y2H分析P8与ZmAKINβγ-2互作的关键结构域 |
| 4.4 P8与ZmAKINβγ的互作分析 |
| 4.4.1 基因克隆及载体构建 |
| 4.4.2 ZmAKINβγ-2与RBSDV编码其它病毒蛋白的互作分析 |
| 4.4.3 P8与AKINβγ同源蛋白的互作分析 |
| 4.4.4 ZmAKINβy-2与SRBSDV编码SP8蛋白的互作分析 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 ZmAKINβγ的表达分析 |
| 5.1 RBSDV侵染对ZmAKINβγ转录水平的影响 |
| 5.1.1 ZmAKINβγ在苗期玉米不同组织中的表达水平分析 |
| 5.1.2 RBSDV侵染不同阶段对ZmAKINβγ达水平的影响 |
| 5.2 ZmAKINβy在玉米原生质体细胞中的亚细胞定位 |
| 5.2.1 载体构建 |
| 5.2.2 ZmAKINβγ在玉米原生质体细胞中的亚细胞定位 |
| 5.2.3 ZmAKINβγ在本生烟细胞中的亚细胞定位 |
| 5.3 RBSDV侵染影响ZmAKNβγ的亚细胞定位 |
| 5.4 P8影响ZmAKINβγ的生物学活性 |
| 5.4.1 载体构建 |
| 5.4.2 P8影响ZmAKINβy的γ亚基功能 |
| 5.5 小结与讨论 |
| 第六章 ZmAKINβγ对RBSDV侵染的影响及参与的生理途径 |
| 6.1 BMV VIGS沉默ZmAKINβγ基因 |
| 6.1.1 构建沉默载体并在本生烟中扩繁BMV病毒粒子 |
| 6.1.2 沉默ZmAKINβγ基因的玉米无明显表型变化 |
| 6.1.3 沉默玉米ZmAKINβγ基因促进RBSDV侵染 |
| 6.2 BMV VIGS沉默ZmAKINβγ因影响玉米糖代谢 |
| 6.2.1 沉默ZmAKINβγ基因影响糖代谢相关基因的表达 |
| 6.2.2 沉默ZmAKINβγ基因调控糖类物质积累量 |
| 6.3 ZmAKINβγ影响RBSDV侵染所参与的生理途径 |
| 6.3.1 RBSDV侵染影响玉米糖代谢相关基因的表达 |
| 6.3.2 RBSDV侵染影响糖类物质积累量 |
| 6.3.3 葡萄糖处理促进RBSDV积累 |
| 6.3.4 蔗糖和硝酸银处理不影响RBSDV积累 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 ZmAKINβγ生理功能的探索 |
| 7.1 ZmAKINβγ响应不同类型病毒的侵染 |
| 7.2 ZmAKINβγ-2在本生烟叶片中诱发细胞坏死反应 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 结论与展望 |
| 1. 主要结果和结论 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ: RBSDV侵染玉米产生的病毒源小干扰RNA的特征 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 引物列表 |
| 附表1 实时荧光定量RT-PCR所用的引物 |
| 附表2 载体构建和检测所用引物 |
| 个人简介 |
四、苜蓿花叶病毒复制酶(P_2亚基)基因全长cDNA植物表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]凤果花叶病毒和苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其应用[D]. 何宛芹. 浙江大学, 2021(01)
- [2]大豆GmCBL4基因启动子和GmCBL10基因的克隆及遗传转化[D]. 张静. 哈尔滨师范大学, 2020(01)
- [3]小麦黄花叶病毒不依赖帽子翻译的差异化调控研究[D]. 耿国伟. 山东农业大学, 2020(08)
- [4]高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究[D]. 梅琼. 沈阳农业大学, 2019(08)
- [5]苜蓿花叶病毒的研究进展[J]. 李梅蓉,孙媛,卢建霖,苏荣,沈并兵,朱芹. 贵州农业科学, 2019(04)
- [6]水稻条纹病毒基因组包壳及NSvc2蛋白介导灰飞虱传毒机制研究[D]. 卢刚. 南京农业大学, 2018(02)
- [7]中国小麦花叶病毒致病相关功能域（VRpep）研究及小麦黄花叶病毒siRNA在小麦不同组织中的比较分析[D]. 李林颖. 南京农业大学, 2018(07)
- [8]大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析[D]. 张坤. 中国农业大学, 2017(05)
- [9]BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究[D]. 周翠姬. 中国农业大学, 2017(05)
- [10]玉米AKINβγ蛋白与水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的分子互作研究[D]. 李明骏. 中国农业大学, 2017(05)