一、Survival and differentiation of transplanted neural stem cells in mice brain with MPTP-induced Parkinson disease（论文文献综述）
朱缓[1]（2021）在《iPSCs-iGABA能神经元前体定向移植帕金森大鼠修复效应研究》文中研究指明目的:探索猪iPSCs逐步诱导分化为GABA能神经元前体的方法体系;建立稳定的6-羟基多巴胺（6-OHDA）单侧损毁的帕金森模型大鼠,完善帕金森模型大鼠运动障碍的有效评估体系;研究移植猪iPSCs-i GABA能神经元前体修复帕金森大鼠运动功能的效应作用。方法:猪iPSCs诱导分化为GABA能神经元前体遵循两个阶段,第一阶段,猪iPSCs悬浮培养,第3天时形成类胚体（EBs）,采用神经诱导培养基NIM（SB431542、DMH1、FGF2）继续诱导,第12天分化为原始神经上皮细胞（NECs）。第二阶段,使用含Pur、B27的NIM培养基悬浮培养形成神经球（NS）,至第21天时形成GABA能神经元前体,同时检测NECs、GABA能神经元前体的细胞表型及功能效应;通过脑立体定位仪,采用6-OHDA两点右侧内侧前脑束注射法制备帕金森模型大鼠。术后2周,阿扑吗啡（APO）诱导旋转试验筛选成功的帕金森大鼠模型。将猪iPSCs-i GABA能神经元前体移植帕金森大鼠脑黑质-纹状体区,通过APO诱导旋转实验、旷场实验、水迷宫实验和疲劳转棒实验,比较对照组、模型组和移植组大鼠的运动协调能力。移植细胞8周后,各组大鼠取脑进行HE染色,观察损伤部位的细胞数量变化。免疫组化法检测各组酪氨酸羟化酶（TH）的表达;细胞移植后8周、32周,免疫荧光法观察移植后的i GABA能神经元前体在宿主脑内微环境中的存活、迁移及分化状况;Western Blot试验检测各组TH、GFAP及Synaptophysin蛋白表达水平。结果:猪iPSCs在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性标记OCT4、Nanog、SSEA1和TRA-160,并且核型分析显示没有其他物种来源细胞污染。第12天经诱导分化获得NECs能够形成玫瑰花环结构,约90%能够表达其表面标记物PAX6、SOX2和Nestin与神经微管蛋白标志物Tuj1。第21天90%以上的细胞诱导成为NKX2.1+和FOXG1+的i GABA神经元前体细胞。与模型组相比,细胞移植组大鼠的APO诱导旋转实验、旷场实验,水迷宫实验和疲劳转棒实验存在显着性差异（p<0.01）。行为学试验表明移植细胞后的帕金森大鼠运动功能显着改善。移植细胞8周后,HE染色结果表明,模型组大鼠的损伤区域细胞量显着较少,且排列紊乱。移植组大鼠的细胞量较模型组增多,细胞排列较规则。TH免疫组化结果显示模型组大鼠损伤区域的TH表达量较对照组明显减少,而移植组大鼠的TH表达量相较模型组明显增多。移植细胞后8周、32周,观察免疫荧光结果,可见CM-Di I阳性的细胞,同时也表达神经元标志物Nestin和b-Ⅲ-tubulin、多巴胺神经元标志物TH、GABA能神经元标志物GABA、突触标志物Synaptophysin和星型胶质细胞标志物GFAP。Western Blot检测结果显示,模型组大鼠TH和Synaptophysin的含量明显比对照组降低,而移植组大鼠TH和Synaptophysin的表达量较模型组显着增高。模型组大鼠的GFAP含量较对照组没有明显的减少,而细胞移植8周后,GFAP的含量和模型组相比显着升高。结论1、本研究通过两个阶段,结合无血清培养基筛选法逐步定向诱导猪iPSCs高效分化为前脑GABA能神经元前体,为i GABA能神经元前体移植治疗神经损伤疾病奠定基础。2、6-OHDA两点注射右侧内侧前脑束制备偏侧损毁的帕金森大鼠模型是一种高效的建模方法,并且利用APO诱导旋转实验,辅以旷场实验、水迷宫实验和疲劳转棒实验,完善了帕金森大鼠运动行为学的评估体系。3、移植细胞在帕金森大鼠脑微环境中可存活32周,发生广泛迁移,并且分化为不同的功能性神经元,与自体神经元产生突触连接。
孙婷[2]（2021）在《新结构化合物生物碱异黄酮LY01和外泌体抗帕金森病的疗效及分子机制研究》文中研究指明中国有着丰富多彩的民族传统医药学,蒙医药学是其中的重要组成部分,具有相对完整的理论体系,丰富的临床实践以及较为完整的文献记载。蒙药嘎顺-包日其格,拉丁名为Sophora alopecuroidesL.,干燥全草和种子用药,能安五脏、定志益精,具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫的功效,临床上常用于湿热泻痢,疮疖溃疡,吞酸胃痛等多种疾病和症状的治疗,值得深入研究,从中筛选治疗重大疾病的创新药物。本实验室前期利用靶向筛选技术从嘎顺-包日其格中获得的新结构化合物LY01,分子量486,具有生物碱和异黄酮的双重结构,结构新颖。实验证明LY01能够抗神经损伤、减轻神经元慢性炎症,影响神经干细胞迁移、分化,具有抗神经退行性病变的作用,有应用前景,值得开发。但其药理作用和分子机制尚不清楚,亟待研究。帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）,蒙医学称之为“彻彻热乎病”,属于“赫依”型白脉病。在蒙医药学中,白脉泛指神经,“源出脑中,向下循行”,分布到五脏六腑和四肢,主司运动和知觉等功能。蒙医学认为人体中保持着相互对立统一的状态,一旦人体受到外因干扰,致使平衡失调时,就会引起疾病。帕金森病是世界第二大神经退行性疾病,发病率高,现代医学治疗困难。其发病的机制至今仍然不明确,近年来外泌体在神经退行性疾病中的作用受到广泛关注。外泌体是一类从细胞内释放到外环境的膜性囊泡,由含有跨膜蛋白的双层脂质和一个内核组成,在细胞间信息交流和生物分子传递中发挥重大作用,易于进入细胞影响关键节点基因的mRNA活性,并参与众多生理和病理过程。目的本研究通过体内外实验研究蒙药嘎顺-包日其格抗白脉病关键活性成分LY01的药理作用和科学机制,评价其对帕金森病模型小鼠和细胞的神经保护作用,并研究LY01对帕金森病中外泌体的调节作用,从行为学、病理学和分子生物学等层面探索LY01在帕金森病模型中发挥神经保护作用的机制,为源于民族药资源宝库的新结构先导化合物的开发提供关键技术资料,阐释民族药抗白脉病的科学性。本研究研究内容分四部分。第一部分LY01对帕金森病模型小鼠的神经保护作用方法1)使用经典的神经毒性药物（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐,MPTP）诱导法和C57BL/6小鼠复制帕金森病小鼠模型。20mg/kg MPTP,腹腔注射4次,每次间隔2 h。小鼠随机分为6组:正常对照组,模型对照组,LY01低剂量组,LY01中剂量组,LY01高剂量组,阳性对照组（红景天苷,50mg/kg,Salidroside）。LY01给药方案是在第一次注射MPTP前1小时,腹腔分别注射0.067 mg/kg,0.2mg/kg,0.6mg/kg浓度的LY01,之后每天一次,共计10天。2)利用转棒测试法评价小鼠的运动协调和平衡能力;3)利用组织免疫荧光、免疫组化和组织免疫印迹技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中多巴胺能神经元和酪氨酸羟化酶（TH）蛋白水平;4)利用RT-PCR技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中炎症相关因子 IL-10、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、TGF-β 的 mRNA 水平;5)利用常规生物化学法检测血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平;6)利用组织免疫印迹法检测黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白水平。结果1)LY01显着增加了帕金森病模型小鼠在转棒上的运动时间（p<0.01）;2)LY01显着减少帕金森病模型小鼠黑质致密部多巴胺能神经元丢失（p<0.05）,增加纹状体组织中多巴胺神经元的神经纤维,增加黑质致密部和纹状体组织中TH蛋白水平（p<0.05）;3)LY01显着降低了 IL-1β、IL-6的mRNA表达水平,升高了 IL-4、TGF-β mRNA 水平（p<0.05）;4)LY01显着降低小鼠血清中丙二醛水平（p<0.001）,增加超氧化物歧化酶水平（p<0.01）;5)LY01显着增加小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中Bcl-2/Bax水平（p<0.05）。结论LY01具有改善帕金森病模型小鼠运动平衡能力,减少脑内黑质致密部和纹状体组织中神经元丢失,减轻氧化应激损伤,缓解神经炎症,减少细胞凋亡的作用。第二部分LY01对帕金森病细胞模型的保护作用方法1)不同浓度的LY01（3.125μM、6.25 μM、12.5 μM）处理人源神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,预保护1 h后,使用1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶离子（MPP+）建立帕金森病细胞模型,共同处理细胞24 h;2)MTT法检测SH-SY5Y细胞活力;3)常规生物化学法检测细胞内总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平;4)利用脂多糖（LPS）诱导小鼠小胶质细胞BV2建立抗炎评价模型,不同浓度的 LY01（3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM）预处理 1h 后加入含LPS的培养基,共同处理细胞24 h后,RT-PCR法检测BV2细胞中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS 的 mRNA 表达量。结果1)浓度为 3.125μM、6.25μM、12.5 μM 和 25μM 的 LY01 均能够增加 SH-SY5Y 细胞的活力（p<0.05,p<0.01,p<0.05,p<0.41）;2)浓度为 3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM 的 LY01 均能够增加 SH-SY5Y 细胞 SOD 和 T-AOC,显着减少 MDA 水平（p<0.01,p<0.01,p<0.05）;3)浓度为 3.125 μM、6.25 μM、12.5 的 LY01 显着减少 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS 的 mRNA 表达量（p<0.01,p<0.05）。结论LY01改善MPP+引起的SH-SY5Y细胞活力降低,减轻氧化应激损伤;减轻LPS诱导的BV2细胞炎症反应。第三部分LY01对帕金森病模型小鼠外泌体的调节作用方法1)使用MPTP诱导C57BL/6小鼠建立帕金森病小鼠模型。小鼠随机分为三组:正常对照组,模型对照组,LY01高剂量组。在第一次注射MPTP前1小时,腹腔注射0.6 mg/kg的LY01,之后每天一次,共计10天。2)使用广泛靶向的代谢组学评估正常对照组和模型对照组小鼠血清和大脑中外泌体代谢物的差异;3)使用广泛靶向的代谢组学评估模型对照组小鼠和LY01治疗小鼠之间血清外泌体代谢物的差异。结果1)代谢组学结果显示,PD模型小鼠和对照组小鼠血清中的外泌体代谢物有69个具有显着差异,脑组织中外泌体代谢物有148个具有显着差异,血清和脑组织外泌体中共有的差异代谢物有25个;2)PD模型小鼠和LY01治疗小鼠的血清外泌体代谢物共有15个具有显着差异;3)上述差异表达的代谢物显着富集酪氨酸代谢通路、嘌呤代谢通路,烟酸和烟酰胺代谢通路,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等与帕金森病相关的通路中。结论LY01治疗帕金森病的机制与调控外泌体代谢物L-多巴有关,其中的机制与酪氨酸代谢通路、嘌呤代谢通路,烟酸和烟酰胺代谢通路,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等通路相关。第四部分外泌体对帕金森病模型小鼠的神经保护作用及机制研究方法1)小鼠随机分为三组:正常对照组,模型对照组,外泌体组。在MPTP诱导的C57BL/6小鼠建立帕金森病小鼠模型上,注射健康志愿者血液来源的外泌体,共计4次;2)利用转棒测试法评价小鼠的运动协调和平衡能力;3)利用组织免疫荧光、免疫组化和组织免疫印迹技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中多巴胺能神经元和TH蛋白水平;4)利用实时荧光定量PCR技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中炎症相关因子的mRNA水平;5)利用常规生物化学法检测血清中SOD和MDA水平;6)利用组织免疫印迹法检测黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白水平。结果1)外泌体显着增加了帕金森病模型小鼠在转棒上的运动时间（p<0.01）;2)外泌体显着减少帕金森病模型小鼠黑质致密部多巴胺能神经元丢失（p<0.0001）,增加纹状体组织中多巴胺神经元的神经纤维,增加黑质致密部和纹状体组织中TH蛋白水平（p<0.05）;3)外泌体显着降低了 IL-1β、IL-6的mRNA表达水平,提高了IL-4、IL-10、TGF-β mRNA 水平（p<0.05）;4)外泌体显着降低小鼠血清中MDA水平（p<0.01）,增加SOD水平（p<0.05）;5)外泌体显着增加小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中Bcl-2/Bax水平（p<0.05）。结论来自健康志愿者的血源性外泌体缓解了小鼠受损的运动协调性,挽救了 PD模型小鼠黑质和纹状体多巴胺能神经元的损失,恢复PD模型小鼠氧化应激、神经炎症和细胞凋亡的内稳态。综上,本研究证实了 LY01对帕金森病模型小鼠和细胞具有神经保护作用,发现其中的机制与LY01调节外泌体代谢物有关,并进一步证实外泌体参与帕金森病的发病机制。本研究发掘了民族药嘎顺-包日其格治疗白脉病的优势,为其临床使用提供了理论基础和科学依据,为活性成分LY01发挥神经保护作用提供了研究基础,增加了研发价值。
林昱[3]（2020）在《苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠不同脑区GDNF-PI3K通路的影响》文中进行了进一步梳理目的:观察苁蓉舒痉颗粒对鱼藤酮诱导的帕金森病模型大鼠中脑纹状体、前额叶皮层区形态学与GDNF及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响,探索苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠的神经保护作用及在不同脑区的作用。方法:以鱼藤酮葵花油乳化液（1.5 mg/kg/d）建立PD大鼠模型,再采用随机方法将造模成功的大鼠分为正常组、溶剂组、模型组、苁蓉舒痉颗粒低、苁蓉舒痉颗粒中剂量组、苁蓉舒痉颗粒高剂量组,其中正常组不予任何处理,溶剂组大鼠予颈背部注射等剂量葵花油乳化液,苁蓉舒痉颗粒低、中、高剂量组分别予0.242g/kg、0.483g/kg、0.966g/kg浓度苁蓉舒痉颗粒颗粒药液灌胃处理14 d,同时对正常组与溶剂组予等体积生理盐水灌胃处理。在造模结束及药物干预7 d、14 d分别开展行为学观察;并采用HE染色法与免疫组织化学法检测大鼠纹状体与前额叶皮层及GDNF、PTEN蛋白的表达情况,WB法检测上述脑区GDNF、PI3K、p-PI3K、PTEN蛋白表达情况。结果:1行为学观察结果1.1悬挂试验:造模14 d后,与正常组相较,模型组与各给药组大鼠悬挂评分均减少（P<0.01）;给药7 d后,与模型组相较,中、高剂量组大鼠评分增加（P<0.05或P<0.01）;给药14 d后,与模型组比较,中、高剂量组大鼠评分增加（P<0.05或P<0.01）。1.2歩幅试验:造模14 d后,与正常组相较,模型组及各给药组大鼠步幅长度减少（P<0.01）;给药7 d后,与模型组相较,中、高剂量组大鼠步幅长度增加（P<0.01）;给药14 d后,与模型组相较,中、高剂量组大鼠步幅长度增加（P<0.01）。2 HE染色变化2.1纹状体部位HE染色变化:正常组大鼠纹状体神经元细胞排列、数量及整体形态均正常,模型组大鼠纹状体区域较正常组神经元细胞数量减少,排列与整体形态发生改变;给药后的大鼠纹状体部位细胞数较模型组有所增加,整体形态与排列情况得到改善,上述改变在中、高剂量组尤为明显。2.2前额叶皮层部位HE染色变化:正常组大鼠前额叶皮层神经元细胞排列、数量及整体形态均正常,模型组大鼠前额叶皮层区域较正常组神经元细胞数量减少,排列与整体形态欠佳;给药后的大鼠前额叶皮层部位细胞数较模型组有所增加,整体形态与排列情况得到改善。3免疫组织化学法检测不同脑区GDNF、PTEN表达的变化3.1纹状体GDNF、PTEN表达的变化:给药14 d后,与正常组相比,模型组大鼠纹状体GDNF表达降低（P<0.01）,PTEN表达升高（P<0.01）;与模型组相比,各给药组大鼠纹状体GDNF表达升高（P<0.01）,各给药组大鼠纹状体PTEN表达降低（P<0.01）。3.2前额叶皮层GDNF、PTEN表达的变化:给药14 d后,与正常组相比,模型组大鼠前额叶皮层GDNF表达降低（P<0.01）,PTEN表达升高（P<0.01）;与模型组相比,各给药组大鼠前额叶皮层GDNF表达升高（P<0.01）,各给药组大鼠前额叶皮层PTEN表达降低（P<0.01）。4 WB法检测不同脑区GDNF-PI3K相关蛋白表达的变化4.1纹状体GDNF-PI3K相关蛋白表达的变化:给药14 d后,与正常组相较,模型组大鼠纹状体GDNF、PI3K磷酸化表达减少（P<0.01）,PTEN表达增加（P<0.01）,p-PI3K/PI3K比值降低（P<0.05）;与模型组相较,中、高剂量组大鼠纹状体GDNF蛋白表达增多（P<0.05或P<0.01）,高剂量组大鼠纹状体PI3K磷酸化表达增多（P<0.01）,高剂量组大鼠纹状体p-PI3K/PI3K比值增高（P<0.05）,各给药组大鼠纹状体PTEN蛋白表达减少（P<0.05或P<0.01）。4.2前额叶皮层GDNF-PI3K相关蛋白表达的变化:给药14 d后,与正常组相较,模型组大鼠前额叶皮层GDNF表达减少（P<0.01）,PTEN表达增加（P<0.05）;与模型组相较:各给药组大鼠前额叶皮层GDNF蛋白表达增多（P<0.05或P<0.01）;中、高剂量组大鼠前额叶皮层PTEN蛋白表达降低（P<0.05）。各组大鼠前额叶皮层中PI3K及其磷酸化表达与p-PI3K/PI3K比值差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.苁蓉舒痉颗粒可改善PD模型大鼠行为学障碍,可增加PD模型大鼠纹状体与前额叶皮层GDNF-PI3K通路相关蛋白表达,抑制PTEN的表达,促进PD模型大鼠纹状体GDNF-PI3K信号通路活化;2.苁蓉舒痉颗粒对PD模型大鼠中脑纹状体、前额叶皮层区域均具有神经保护作用,其中,对纹状体的神经保护作用较对前额叶皮层更为显着;3.苁蓉舒痉颗粒可能通过促进纹状体与前额叶皮层GDNF-PI3K信号通路的活化,抑制PTEN表达,在PD不同阶段起到神经保护作用。
刘霖颖[4]（2020）在《帕金森病靶向输递体系用于基因-化药协同治疗的研究》文中指出对于以帕金森病为典型的神经退行性疾病,目前治疗方法的瓶颈在于无法缓解多巴胺能神经元退行性病变进程。对于有望逆转神经元退行性病变的药物如基因药物和化学药物,其脑部递送存在以下共性关键科学问题:单一效果不佳,药物组织渗透差,病灶富集低,可控释药难及难以示踪。现有用于脑疾病研究的纳米药物主要依赖于血脑屏障（BBB）的简单渗透或靶向神经元（例如使用CPP和其他肽）的开发。然而,由于大脑生理机能复杂且药物传递障碍是连续的,因此这些单一的传递步骤解决方案通常不具有高效性。因此,通过合理设计实现脑部组织的高效药物富集是脑部疾病药物递送的难点。基于此,我们构建了一种CT可视化金纳米颗粒基因-化药联合递送体系。该体系可实现药物脑部高效富集和协同治疗,具体内容如下:（1）该体系实现了药物的级联靶向:通过细胞穿透肽B6介导纳米颗粒通过血脑屏障渗透进入脑部组织,马吲哚介导纳米颗粒靶向神经元,显着提高药物在病灶的富集。（2）该体系实现了药物的可控释放:利用载体中硫醚键在H2O2响应下释放药物,实现载体在神经元内可控释药。（3）该体系实现了药物输递过程的可视化:在该Fe3+响应性金纳米颗粒造影剂内核的作用下,患病小鼠脑部CT区域有信号增强,提示纳米颗粒在脑部富集。在治疗效果方面,该联合给药纳米颗粒可发挥协同作用,有效改善帕金森病小鼠运动行为学特征,尤其在改善小鼠脑部黑质区多巴胺能神经元α-Syn蛋白和恢复小鼠脑部黑质区神经元数目等方面具有显着性作用。因此,该可视化靶向纳米系统可为缓解多巴胺能神经元退行性病变提供载体平台。针对现有传统合成递送系统存在天然免疫应答和入胞方式不佳等问题,外泌体因其血液循环的免疫惰性和膜融合入胞等优势被应用于脑部疾病的药物递送,但现有研究中外泌体难以实现将基因药物和化学药物同时高效递送至脑部病灶。因此,利用天然载体实现其携载药物在脑部组织的高效药物富集是脑部疾病药物递送的难点。本课题构建了外泌体涂层聚合物杂化联合递送纳米颗粒用于基因药物siSNCA和姜黄素协同治疗。主要方法由合成和组装过氧化氢响应的基因-化药聚合物载体,外泌体的分离和靶向多肽修饰以及复合物组装三部分组成。该体系可实现药物脑部高效富集,具体内容如下:（1）该体系实现了药物的脑部组织渗透和病灶富集:通过外泌体表面修饰的靶向多肽RVG介导纳米颗粒通过血脑屏障渗透进入脑部组织并靶向神经元,显着提高药物在病灶的富集;（2）该体系实现了药物的可控释放:利用外泌体膜融合作用,改善双载药聚合物内吞方式由内涵体途径转为膜融合途径,释放聚合物双载药内核于细胞质,载体内核中苯硼酸基团在H2O2响应下释放药物,实现载体在神经元内可控释药。在治疗效果方面:（1）上述高效递送优势可增强siSNCA和姜黄素协同治疗效果。（2）该体系在多种动物帕金森病模型治疗中获得良好效果:分别在MPTP诱导的帕金森病小鼠,纹状体内单侧注射α-Syn寡聚体帕金森病大鼠,纹状体内单侧注射α-Syn寡聚体帕金森病食蟹猴模型行为学改善中均发挥了积极作用。（3）本研究初步证实了该体系对T细胞免疫抑制作用,其可为研究未成熟树突状外泌体载体系统的治疗提供新思路。因此,本课题基于基因药物siSNCA和化学药物姜黄素对α-突触核蛋白聚集体清除的潜在协同作用,围绕基因-化学药物联合递送策略展开,构建了两种靶向递送体系:CT可视化金纳米颗粒基因-化药联合递送体系和外泌体涂层聚合物杂化联合递送纳米颗粒,实现了脑部疾病药物递送的联合给药,高药物组织渗透,高病灶富集,可控释药和可视化递送,解决了基因和化药在脑部的高效富集的难点,缓解了神经元退行性病变,为帕金森病靶向治疗提供前瞻性方案。
吕颖[5]（2020）在《LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究》文中研究说明目的（1）建立hiPSCs向多巴胺（dopamine,DA）能神经元的诱导分化体系,系统分析诱导分化过程中lncRNAs的表达和功能变化,进一步筛选并探究关键lncRNA MIAT在hiPSCs及诱导分化中的作用。（2）探讨6-OHDA大鼠帕金森（Parkinson’s disease,PD）模型不同脑区基因表达的改变并筛选PD关键基因与通路,为研究PD的分子机制和防治提供新思路。（3）系统比较并评价神经干细胞、间充质干细胞及其诱导细胞、hiPSCs诱导分化细胞移植治疗PD的效果,为移植细胞的选择和时间点的确定提供实验基础。方法（1）单层贴壁培养法建立hiPSCs向DA能神经元的诱导分化体系,RT-qPCR和免疫荧光染色检测神经相关标记物划分细胞所处阶段。将诱导分化中不同阶段细胞进行lncRNAs转录组测序和生物信息学分析,包括基因表达分析、差异基因分析、lncRNAs靶基因预测和功能富集分析。筛选关键lncRNA MIAT进行RT-qPCR表达验证,Cas9转录激活慢病毒构建MIAT过表达稳转细胞系,RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色检测MIAT在hiPSCs及其向DA能神经元诱导分化中相关标记物的表达。（2）脑立体定位手术构建6-OHDA大鼠PD模型,阿扑吗啡诱导旋转测试筛选成功PD模型,免疫组化检测黑质DA能神经元的含量,高效液相色谱检测纹状体 DA、二羟苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid,DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量。分离5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）进行转录组测序、生物信息学分析和RT-qPCR验证。透射电镜观察超微结构改变。（3）移植细胞分组包括:神经干细胞（neural stem cells,NSCs）、绒毛膜间充质干细胞（human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells,hpcMSCs）、脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cell,CB-MNC）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）及其诱导6天、12天、24天的细胞、hiPSCs诱导分化11天、18天和25天的细胞。新型氧化铁纳米颗粒（molday ion rhodamine B,MIRB）标记干细胞并通过脑立体定位手术进行细胞移植。阿扑吗啡诱导旋转测试、旷场试验和抓力测试对动物进行行为学评价。核磁观察细胞在活体脑内的情况,免疫荧光染色观察移植细胞的迁移、增殖、分化以及星形胶质细胞的改变。透射电镜观察脑组织超微结构变化。结果（1）建立了 hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系。细胞诱导分化至5-7天处于NSCs阶段,至第1 1天开始进入DA能神经元前体细胞阶段,至第25天TH+神经元的比例约为40%左右。诱导分化体系中存在普遍的lncRNAs差异表达和功能调控。在转录本水平和基因水平存在大量的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。差异lncRNAs靶基因和差异mRNAs功能富集结果总体相一致,主要参与轴突导向、（Wnt/TGF-β/Hedgehog/MAPK/p53）信号通路、神经退行性疾病（PD/AD/HD）、代谢途径和细胞周期等。iPSCd0 vs iPSCd7前20项显着富集的功能还包括神经元分化调节、中枢神经系统发育、Wnt信号和凋亡等,与诱导分化密切相关。MIAT及其靶基因MAPK10在iPSCd7组的表达量高于iPSCd0组（p<0.05）,与测序结果相一致。hiPSC-MIAT细胞呈克隆状增殖生长,多能性基因的表达水平与hiPSCs无统计学差异,碱性磷酸酶染色阳性且大量表达OCT4阳性细胞。hiPSC-MIAT诱导至第5天即可见大量细胞向外伸展生长呈分化状态,OCT4、EN1、NURR1基因表达水平高于对照组（p＜0.05）,SOX1和PAX6基因表达水平低于对照组（p<0.05）。（2）成功构建了 6-OHDA大鼠PD模型,黑质TH+神经元减少约90%以上,纹状体DA、DOPAC和HVA的含量分别为对照组的4.28%、8.40%、4.96%。模型大鼠5个脑区均发生了基因改变,GO和KEGG功能富集分析显示DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。韦恩分析5个脑区共有DEGs为Ephx2和Faml11a。PPI分析纹状体主要节点基因为Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh。DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的共有级联结构,即以Gi/o为中心的Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK。PD模型5个脑区均存在不同程度的线粒体形态异常。（3）阿扑吗啡诱导旋转测试显示,ADSCd12、iPSCd18和iPSCd25有效比例较高且有效时长到达观察终点32周,其中iPCSd18组有效比例最高。与对照组相比,干细胞移植各组大鼠肌力均有所提升（p<0.05）,移植各组之间无统计学差异。与对照组相比,移植大鼠的总活动路程和总运动时间均显着升高（p<0.05）,各移植组之间无统计学差异。与对照组相比,移植组大鼠的跨区域次数增加,其中ADSCd12组高于iPSCd25组（p<0.05）。MIRB标记的移植细胞能够在脑内生长,细胞移植后能够发生迁移,迁移方式包括局部迁移、向胼胝体迁移和跨脑区的远程迁移。细胞移植后8周,部分移植细胞PCNA染色阳性,移植后32周PCNA+细胞较少。iPSCd18组细胞移植后32周,部分分化为DA能神经元表达TH阳性。细胞移植后8周针道周围大量星形胶质细胞被激活,呈纤维束网状或胞体增大增厚,移植后32周表达减少。细胞移植后8周,大鼠5个脑区的线粒体形态异常均有不同程度的改善。结论（1）hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系中,细胞诱导5-7天处于NSCs阶段,11天进入DA能神经元前体细胞阶段,25天TH+细胞比例约为40%。（2）hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中存在广泛的lncRNAs表达和功能变化,部分功能调节与诱导分化关系密切。（3）LncRNA MIAT及其靶基因MAPK10在诱导第7天细胞中表达升高。过表达MIAT不影响hiPSCs的多能性,但在诱导分化过程中促进hiPSCs向中脑DA能神经元前体细胞分化。（4）6-OHDA大鼠PD模型在病理生化和基因水平都能够很好地模拟人类PD,5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）均发生了基因改变,DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。（5）5个脑区的共有DEGs（Ephx2和Faml11a）和纹状体的主要节点基因（Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh）可能是PD分子机制和治疗的关键靶点。（6）DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的以Gi/o为中心的共有级联结构（Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK）,可能是PD突触损伤的关键分子机制。（7）各类干细胞及其诱导细胞移植治疗PD大鼠均能在一定程度上改善动物行为障碍（转数、肌力、自主活动能力）,ADSCd12组、iPSCd18组和iPSCd25组的治疗效果相对较好且维持时间较长,其中iPSCd18组的行为学评价有效比例最高。（8）移植细胞能够在脑内生长并以不同方式迁移,初期具有增殖能力,促进大量星形胶质细胞的表达,后期有所降低,能够分化为DA能神经元,对脑区内线粒体超微结构损伤有一定的改善作用。干细胞功能的年龄依赖性下降在衰老中起着重要作用,但其分子机制尚不清楚。PTRF（polymerase I and transcript release factor）是胞膜窖形成和发挥功能的重要成分,参与调节细胞增殖、内吞作用、信号转导和衰老等生物学功能。本研究旨在通过PTRF转基因小鼠分析PTRF在造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）衰老中的作用。采用流式细胞术检测免疫细胞和造血干/祖细胞的比例;测定HSCs的细胞周期、衰老和ROS表型。采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测衰老相关基因和蛋白的表达水平。结果表明,PTRF转基因小鼠骨髓中HSCs数量明显增多,并表现出G1期细胞周期停滞、SA-β-Gal阳性率增加和活性氧水平升高的衰老表型。PTRF过表达的HSCs在体内、体外的自我更新和造血重建能力也显着降低。PTRF通过 ROS-p38-p16 和 caveolin-1-p53-p21 途径诱导 HSCs 衰老。
陈欢[6]（2020）在《PDGF-BB对PD模型中神经细胞的保护作用及相关机制研究》文中认为帕金森疾病（Parkinson’s Disease,PD）是一种与年龄相关并且严重危害中老年人健康的神经性退行性疾病。该病以多巴胺能神经元渐进性变性脱失,纹状体多巴胺输入受损为主要病理特征。PD是一种多因素疾病,但具体机制仍待进一步阐明。因此,临床上仍采用对症治疗,如L-DOPA补充PD病人缺失的多巴胺。但是这种治疗方法并不能阻止疾病的进展且有毒副作用。血小板源性生长因子-BB（Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）是为数不多经FDA批准投入临床使用的生长因子。近年来,因发现其明显的促进神经再生的作用,研究人员拟探究其作为一种神经保护剂的可能。研究者在PD动物模型中发现PDGF-BB可以促进黑质酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）的表达。与此同时,PDGF-BB临床前实验评估中,研究结果显示PD患者对PDGF-BB是安全且耐受的。这些研究为对PDGF-BB的功效及剂量等研究和临床试验奠定了基础。然而,基于PDGF-BB对神经元的保护功能及分子机制的研究尚未有报道。本课题以当前该领域研究结果为基础,以MPTP/MPP+构建PD实验模型,探索PDGF-BB对受损神经元的保护作用及相关机制。在细胞实验中,结合流式细胞学、CCK-8细胞增值检测法等实验手段,探索PDGF-BB对MPP+损伤的神经元的保护作用。在进一步的机制探索中,借助靶向抑制剂,干扰RNA（siRNA）等药理学实验及基因表达调控手段,在SH-SY5Y细胞系及小鼠原代神经元中进一步探索PDGF-BB介导的神经保护功能相关的下游分子信号通路。最后,在MPTP诱导的PD小鼠模型中,通过侧脑室埋管及连续给药的方式初步验证了PDGF-BB对TH表达的影响。通过研究,本课题实验结果证明在SH-SY5Y细胞系及小鼠原代神经元中,PDGF-BB通过结合PDGF受体激活下游PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路,促进转录因子CREB的活化及转核,在MPP+损伤的神经元细胞中发挥重要的保护作用。并进一步结合体内实验结果,初步验证了PDGF-BB在PD小鼠模型中促进TH的表达。该课题的研究结果为进一步探讨PDGF-BB作为PD的潜在治疗药物提供了可靠的理论依据和实验基础。
李艳霞[7]（2020）在《HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究》文中指出目的:主要探讨PD模型中HtrA2/Omi功能异常与DA神经元凋亡、内质网应激及Wnt信号通路相关性的分子机制,并评估干预HtrA2/Omi、Wnt、GSK3β等分子靶点的神经保护作用。方法:1.采用6羟基多巴胺（6-OHDA）干预PC12细胞,构建PD细胞损伤模型,观察6-OHDA诱导下细胞形态学变化。CCK8法检测细胞活力,筛选最佳造模浓度。免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶（TH）的表达。流式细胞法检测细胞的凋亡率。利用Western Blot免疫印迹（WB）技术检测内质网应激及凋亡相关蛋白α-syn、CHOP、Grp78、active caspase3、XIAP和TH等蛋白水平的改变。siRNA慢病毒转染沉默HtrA2/Omi基因,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测沉默效率。WB法检测细胞内质网应激、凋亡蛋白、Wnt通路蛋白。2.CCK8法筛选Ucf101（HtrA2/Omi的特异抑制剂）的最佳浓度。WB法检测Ucf101对PD模型细胞的内质网应激的影响;采用脑立体定位技术右侧黑质致密部（SNc）和中脑腹侧被盖（VTA）两点注射6-OHDA法,建造PD大鼠模型。分别于术后2周、3周、4周腹腔注射阿扑吗啡（APO）,诱导动物的旋转行为。WB法检测HtrA2/Omi、activate Caspase3、α-syn,内质网应激、凋亡相关蛋白等蛋白的表达。Ucf101持续干预大鼠4周,观察大鼠的行为,免疫组织化学检测中脑组织TH的表达。WB法检测大鼠中脑组织HtrA2/Omi、TH表达、内质网应激、凋亡相关蛋白及Wnt通路蛋白的表达。3.WB法分析PD细胞模型的Wnt通路蛋白的表达;CCK8法筛选最佳的Wnt1蛋白浓度,流式细胞术检测Wnt1蛋白对PD模型细胞凋亡的影响,WB法检测内质网应激相关蛋白的表达;CCK8法筛选最佳的LiCL（GSK3β特异抑制剂）浓度,免疫荧光法检测细胞TH、Wnt1的表达。结果:1.细胞存活率与6-OHDA呈时间剂量依赖性下降的趋势,60μM时细胞的存活率为51.37±2.83%,选择60μM作为6-OHDA-PD细胞模型的造模浓度。PD模型细胞0-24h HtrA2/Omi表达呈升高趋势。与对照组比较,α-syn、Bip/Grp78、CHOP、active caspase3的表达上调,P<0.05;凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达下调,P<0.05,模型组的凋亡率明显升高。沉默HtrA2/Omi基因,HtrA2/Omi mRNA的表达明显下降,P<0.05。与模型细胞组比较,HtrA2/Omi基因沉默组细胞凋亡率升高,α-syn、Bip/Grp78、CHOP、active caspase3的表达上调,P<0.05;凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达下调,P<0.05,加剧了6-OHDA对细胞的内质网应激损伤。GSK3β磷酸化分子tyr216/Ser9比值升高,Wnt通路受抑制。2.Ucf101的干预浓度,2.5uM使细胞活力明显升高,10uM、20uM均使模型细胞活力下降,P<0.05。2.5uM Ucf101可降低模型细胞的凋亡率,10uM Ucf101可加剧模型细胞的凋亡。2.5uM Ucf101预处理PD模型细胞,内质网应激标志分子Bip/Grp78和CHOP的表达下降,P<0.05;Ucf101可改善PD大鼠APO诱导的旋转行为,中脑TH表达增加。Ucf101减少PD大鼠中脑α-syn的积聚,降低ERS水平,下调caspase3,上调TH和XIAP,保护DA神经元。PD大鼠的Wnt-3α、β-catenin下调,p-GSK3β（ser9）/p-GSK3β（tyr216）的比率降低。Ucf101上调PD大鼠的Wnt-3α、β-catenin和p-GSK3β（ser9）,下调p-GSK3β（tyr216）。Ucf101激活PD大鼠DA神经元的Wnt通路,降低GSK3β的活性,保护DA神经元。3.PD模型细胞24h内的p-GSK3β（ser9）、β-catenin、p-Akt的表达呈下降趋势,p-GSK3β（Tyr216）的表达呈上升趋势。6-OHDA抑制了Wnt通路的激活,升高GSK3β的活性。CCK8法筛选Wnt1的最佳浓度为100ng/mL,Wnt1使PD模型细胞的Bip/Grp78和CHOP的表达明显降低。Wnt1可减缓6-OHDA所致的内质网应激及凋亡。LiCL的最佳浓度为2mM,LiCl可使模型细胞的存活率增高,上调Wnt和TH的表达,激活了Wnt信号通路,减轻6-OHDA导致的细胞损伤。结论:1.6-OHDA使体内和体外PD模型上调α-syn、HtrA2/Omi、ER应激及凋亡相关蛋白,抑制Wnt通路,激活GSK3β,促进DA神经元凋亡;2.沉默HtrA2/Omi基因可加剧PD模型细胞的ER应激及凋亡,进一步抑制Wnt通路,激活GSK3β,加重细胞损伤;3.轻度抑制HtrA2/Omi能缓解6-OHDA所致的ER应激,减轻DA神经元的凋亡,激活Wnt通路,抑制GSK3β,具有一定的神经保护价值;4.Wnt1缓解PD模型细胞的ERS,减少细胞凋亡;LiCl下调模型细胞的ERS,减少细胞凋亡,抑制GSK3β,激活Wnt通路,具有一定的神经修复价值;5.证明HtrA2/Omi功能异常与ERS在PD发病机制中可能发挥重要作用,Wnt通路及Wnt、GSK3β等分子在细胞凋亡的级联反应中起关键作用,可能作为PD研究及治疗的靶点。
周囡囡[8]（2019）在《神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植促进PD大鼠神经功能修复及机制研究》文中研究表明帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种多发于老年人的神经退行性疾病,其常见的运动症状有静止性震颤、运动迟缓、肌僵直、姿势反射障碍等,非运动症状有焦虑、睡眠障碍、认知障碍等。近年来,干细胞研究所取得的成就为PD治疗带来了新的希望。PD的主要病理特征为中脑黑质（substantia nigra,SN）多巴胺（dopamine,DA）能神经元的选择性缺失。PD的发病机制目前尚不清楚,但大量研究表明神经炎症在DA能神经元变性丢失过程中起着重要作用。研究表明神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植在改善PD神经炎症微环境中具有重要的作用。嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）因其出色的神经营养功能经常被应用于细胞的联合移植中,被称为移植细胞的“营养泵”。近年来越来越多的证据表明OECs在改善移植细胞炎症微环境中起到重要作用。为研究NSCs与OECs联合移植对PD大鼠神经功能修复作用及其机制,本实验将E1112 d胎鼠中脑来源的NSCs进行体外培养、诱导分化和免疫荧光鉴定,将13d新生鼠嗅球来源的OECs体外培养并进行免疫荧光鉴定。移植前用GFP-HIV转染NSCs以标记NSCs,用Hoechst 33342标记OECs。在成年雄性Wistar大鼠右侧内侧前脑束和黑质两点注射6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）制备PD模型,造模4 w后选择造模成功的PD大鼠进行纹状体（striatum,Str）内细胞移植。移植手术7 d后通过荧光观察细胞移植情况;通过旷场试验（open field test,OFT）、平衡木实验和握力测试检测PD大鼠的自发运动能力、焦虑程度、运动协调能力和肌僵直程度;通过蛋白质免疫印迹（western blot,WB）检测PD大鼠Str及SN脑区中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）蛋白的表达变化和PD大鼠右侧Str脑区中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）和白介素-4（interleukin 4,IL-4）蛋白的表达变化。结果如下:1.NSCs体外培养3代后可见形状规则的神经球,神经球经免疫荧光鉴定呈Nestin阳性,分化后的NSCs免疫荧光鉴定为TH阳性和GFAP阳性。体外培养的OECs呈现双极和多极的细胞形态,且大部分细胞免疫荧光鉴定呈P75NTR阳性。2.利用GFP-HIV转染NSCs标记NSCs,利用Hoechst 33342标记OECs,细胞绝大多数被成功标记。移植手术7 d后,对大鼠脑切片进行荧光观察,对照组和6-OHDA组均未观察到荧光,而各细胞移植组可见与细胞标记物相应的荧光,说明细胞移植成功。3.行为学实验结果显示,与对照组相比,6-OHDA组旷场运动距离较短（P<0.01,n=9-11）,说明6-OHDA组大鼠自发运动能力下降;相比6-OHDA组,联合移植组旷场运动距离较长（P<0.05,n=9-11）,但NSCs或OECs单独移植组旷场运动距离有所增加但无统计学差异,说明NSCs与OECs联合移植组大鼠自发运动能力短期内得到改善。相比对照组,6-OHDA组平衡木得分降低（P<0.001,n=9-11）,说明6-OHDA组大鼠运动协调能力下降;相比6-OHDA组,单独移植组或联合移植组的平衡木得分均略有上升,但差异无统计学意义（P>0.05）,说明单独移植组或联合移植组大鼠运动协调能力短期内无改善。相比对照组,6-OHDA组悬挂持续时间增加,说明6-OHDA组大鼠肌僵直程度增加（P<0.05,n=9-11）;相比6-OHDA组,单独移植组或联合移植组悬挂持续时间均略有下降,但差异无统计学意义（P>0.05）,说明单独移植组或联合移植组大鼠肌僵直症状短期内无明显缓解。4.OFT结果显示,与对照组相比,6-OHDA组的旷场外周与中央活动时间比值（Pt/Ct）变大,说明6-OHDA组大鼠焦虑程度较高（P<0.05,n=9-11）,与6-OHDA组相比,OECs移植组和联合移植组的Pt/Ct变小,说明OECs移植组和NSCs与OECs联合移植组的焦虑程度较低（P<0.05,n=9-11）。5.PD大鼠左侧Str和SN的TH蛋白表达均无变化（P>0.05）。右侧Str的TH蛋白表达变化明显,与对照组相比,6-OHDA组、NSCs移植组、OECs移植组和联合移植组的TH表达量均减少（P<0.001,n=5-7）,而与6-OHDA组相比,NSCs移植组和联合移植组的TH表达量略有增加,但无统计学意义（P>0.05）;右侧SN的TH表达变化明显,与对照组相比,其余四组TH表达量均减少（P<0.001,n=5-7）,与6-OHDA组相比,联合移植组的TH表达量略有增加,但无统计学意义（P>0.05）。6.PD大鼠右侧Str的炎性因子表达变化明显。与对照组相比,6-OHDA组的TNF-α、IL-1β和IL-4表达量均增加（P<0.05,n=5-7）。与6-OHDA组相比,联合移植组的TNF-α和IL-1β表达量减少（P<0.05,n=5-7）,IL-4的表达量略有增加,但无统计学差异（P>0.05）;单独移植组的IL-1β表达量减少（P<0.05,n=5-7）,且TNF-α与IL-4表达量减少,但均无统计学差异（P>0.05,n=5-7）。以上结果表明,NSCs和OECs联合移植7d后PD大鼠的自发运动能力增强,焦虑程度降低;促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量减少,说明联合移植短期内能促进PD大鼠神经功能部分修复,其修复机制可能与促炎因子的表达量减少有关。本研究结果将为今后应用NSCs和OECs联合移植治疗PD供新的实验和理论依据。
李曼[9]（2019）在《人脂肪间充质干细胞介导VEGF189抑制TRPV1缓解帕金森小鼠疼痛的实验研究》文中认为第一部分帕金森病小鼠模型制备及疼痛行为学评估目的:通过在小鼠左侧纹状体注射6-羟基多巴（6-OHDA）的方式构建单侧帕金森（parkinson’s disease,PD）小鼠模型,并从PD模型小鼠的自发疼痛和诱发疼痛的行为学改变等方面,对PD小鼠疼痛行为学进行系统评估。方法:将20只C57BL/6小鼠随机分为PD组和Sham组,每组各10只。采用两点法向小鼠左侧纹状体分别注射6-OHDA（PD组）和等量的生理盐水（sham组）。术后第1周和第2周分别进行阿扑吗啡（APO）诱导旋转实验,旋转实验阳性的小鼠于第2周进行机械痛,热痛,和自发痛的测试。之后每组随机选取3只小鼠,取纹状体组织蛋白,采用Western blot的方法检测纹状体内酪氨酸羟化酶（TH）的含量以及采用免疫荧光的方法检测黑质和纹状体的损伤程度。结果:1.PD组小鼠在注射6-OHDA一周后出现APO诱导的旋转反应,第1周旋转圈数为每小时622.60±21.94圈,第2周旋转圈数为每小时657.40±24.03圈。免疫荧光显示PD组模型小鼠的左侧黑质TH+神经元数量减低,左侧纹状体TH+纤维荧光强度也减低,Western blot显示纹状体TH含量较右侧明显减少,且比较有统计学差异（p<0.05）。上述结果说明,小鼠单侧纹状体内注射6-OHDA可制作稳定的PD模型。2.术后第2周,PD组小鼠右后肢的热痛痛阈较sham组明显减低,PD组小鼠左右后肢以及左右脸颊部机械痛痛阈较sham组也明显减低,且两者比较有统计学差异（p<0.05）。然而PD组小鼠没有表现出自发痛行为学,条件性位置偏爱实验结果与sham组比较无显着性差异。结论:小鼠单侧纹状体内注射6-OHDA可较好的模拟PD疾病特点,且该模型小鼠表现出热痛和机械痛痛觉过敏,可以作为研究PD疼痛的理想实验模型。第二部分TRPV1在帕金森模型小鼠疼痛发生中的机制研究目的:研究6-OHDA损伤疼痛模型小鼠的三叉神经尾侧亚核（Vc）中TRPV1的表达,以及其在PD模型小鼠疼痛发生中的作用。方法:实验采用向小鼠左侧纹状体内注射6-OHDA的方法制备单侧PD小鼠模型。术后第1周进行APO诱导旋转实验,筛选出单侧PD模型小鼠,并于第2周进行脸颊部机械痛测试,筛选出20只PD疼痛小鼠模型用于后续实验。采用免疫荧光方法检测PD疼痛小鼠模型的左右两侧Vc区5-HT,5-HT3AR,和TRPV1的含量,并检测通过基因阻断法在RVM区微量注射Tph2-sh RNA阻断5-HT分泌后,以及给予5-HT3AR拮抗剂（Y25130）和TRPV1受体拮抗剂（AMG9810）后小鼠机械痛痛阈的改变。最后在sham组小鼠右侧Vc区微量注射5-HT3AR激动剂（SR57227）或者生理盐水,检测其行为学改变,并在注射SR57227前30min原位微量注射TRPV1受体拮抗剂（AMG9810）或生理盐水,再次检测其行为学变化。结果:1.PD疼痛模型小鼠右侧Vc区的5-HT含量较左侧明显增高,两者相比有统计学差异（p<0.05）。在RVM区微量注射Tph2-sh RNA后,右侧Vc区5-HT含量明显减少,且右侧机械痛痛阈增高,和sham组小鼠相比无显着性差异。上述结果说明,RVM区下行的5-HT在PD疼痛中起重要作用。2.免疫荧光结果显示PD疼痛小鼠右侧Vc区5-HT3AR含量增高,在Vc区微量注射Y25130后可减轻PD组小鼠右侧脸颊部痛觉过敏现象,与单纯给与对照剂的PD小鼠比较,机械痛阈值明显增高（p<0.05）。sham小鼠右侧Vc区微量注射SR57227后,出现右侧脸颊痛阈降低,与注射对照剂组比较有显着性差异（p<0.05）。而原位注射AMG9810后,痛阈明显增高,与原位注射生理盐水组相比有显着性差异（p<0.05）。3.免疫荧光和Western blot结果显示,PD疼痛小鼠右侧Vc区TRPV1含量增高,在Vc区微量注射AMG9810后可减轻PD组小鼠右侧脸颊部痛觉过敏现象,与给与对照剂的PD小鼠比较,机械痛阈值明显增高（p<0.05）。且原位注射AMG9810可以减轻SR57227引起的痛觉过敏,与原位注射生理盐水组相比有显着性差异（p<0.05）。说明TRPV1的激活在5-HT调控PD疼痛中起重要作用。结论:RVM区下行的5-HT在Vc区通过结合5-HT3A受体,从而激活TRPV1受体,参与PD相关疼痛的调控。第三部分hAMSCs-VEGF189的构建及其治疗PD小鼠疼痛的实验研究目的:分离、培养原代人脂肪间充质干细胞（hAMSCs）,并通过慢病毒感染的方式将VEGF189基因转入hAMSCs,构建VEGF189基因表达的载体。评估hAMSCs-VEGF189用于治疗PD疼痛的安全性及有效性。方法:首先比较单纯注射VEGF189蛋白和对照剂对PD小鼠Vc区TRPV1和5-HT3A受体的影响。然后采用胶原酶消化法分离培养原代hAMSCs,并将携带VEGF189-GFP基因和携带Vector-GFP基因的慢病毒感染hAMSCs,并利用潮霉素筛选,最后用Western blot方法检测hAMSCs-VEGF189-GFP和hAMSCs-Vector-GFP表达VEGF189的情况。将筛选出的PD疼痛模型小鼠随机分为两组,分别微量注射hAMSCs-VEGF-GFP和hAMSCs-Vector-GFP,观察注射后生物发光活体成像（IVIS）在1-6周内的变化,以及注射后第1周和第6周的疼痛行为学的变化,和注射6周后Vc区TRPV1的改变,SN区DA神经元的数量以及肿瘤相关因子的荧光染色情况。结果:1.单纯使用VEGF189可以明显抑制Vc区TRPV1表达,但是不影响5-HT3A表达。Western blot和免疫荧光结果显示hAMSCs-VEGF-GFP能表达VEGF189,而hAMSCs-Vector-GFP不能表达VEGF189,两者比较存在显着性差异（p<0.05）。且hAMSCs-VEGF-GFP和hAMSCs-Vector-GFP均能表达绿色荧光蛋白GFP。2.IVIS实验显示hAMSCs-VEGF-GFP在小鼠Vc区注射后呈稳步衰减,到第6周时荧光强度明显减低,与第1周相比有显着性差异（p<0.05）。第6周的切片染色结果显示,并无肿瘤相关因子表达,证明AMSCs-VEGF-GFP局部注射无成瘤性,安全可行。3.原位注射hAMSCs-VEGF-GFP后,Vc区TRPV1表达减少。且机械痛痛阈检测显示,hAMSCs-VEGF-GFP注射后PD小鼠右侧脸颊的疼痛阈值显着增高,和hAMSCs-Vector-GFP注射后疼痛阈值相比有显着性差异（p<0.05）。hAMSCs-VEGF-GFP和hAMSCs-Vector-GFP都不影响PD模型小鼠黑质DA神经元数量。结论:VEGF基因经慢病毒感染转入hAMSCs内,在体内体外均可稳定表达VEGF189。hAMSCs-VEGF-GFP原位注射入PD小鼠Vc区不引起肿瘤生长,且其分泌的VEGF189可通过抑制TRPV1表达来提高小鼠机械痛痛阈,并不影响PD疾病本身进程。
杨晓霞[10]（2019）在《小胶质细胞在MPTP诱导的多巴胺神经元死亡中的作用及机制》文中指出研究背景及目的:帕金森病（PD）是以多巴胺神经元的进行性缺失和运动障碍为特点的神经退行性疾病。作为大脑脑内的免疫细胞,小胶质细胞率先对神经损伤发生反应。小胶质细胞与脑内固有细胞密切联系,并与外周透过血脑屏障浸润到脑内的白细胞发生反应。取决于所处的环境,时间以及疾病的具体特征,小胶质细胞在激活后,可以产生多种细胞因子和神经营养因子,从而影响神经炎症的转归和神经损伤的预后。然而,目前还不清楚在帕金森病这一特定的病理环境下,小胶质细胞对脑内炎症和多巴胺神经元死亡的具体影响。小胶质细胞的存活主要依赖于集落刺激因子1受体（CSF1R）信号转导。新近研究发现CSF1R抑制可以几乎完全清除中枢神经系统中的小胶质细胞,而对其他脑细胞如神经元,星形胶质细胞或少突胶质细胞没有明显影响。因此,在本研究中我们使用CSF1R抑制剂PLX3397删除了小胶质细胞,研究了清除小胶质细胞对MPTP诱导的PD小鼠模型中神经炎症和多巴胺能神经毒性的影响,从而揭示了小胶质细胞在多巴胺神经元损伤中的作用及相关机制。研究方法:我们使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导小鼠PD模型。在MPTP注射前,小鼠以40mg/kg/天的剂量给予PLX3397,持续21天,以删除脑内小胶质细胞。MPTP注射后第7天通过转棒实验和爬杆实验进行运动功能评估以及免疫组化染色进行多巴胺系统病理损伤的评价;流式细胞术监测脑内的免疫细胞包括T细胞,B细胞,NK细胞,巨噬细胞和中性粒细胞反应以及星形胶质细胞的活动,同时结合免疫荧光染色,观察脑内免疫细胞变化。另一方面,为检测小胶质质细胞删除对MPTP诱导的局部炎症的影响,我们使用RT-PCR的方法检测了黑质和纹状体组织中炎性因子的表达,包括IL-1β,TNF-α,IL-2,IL-6,IFN-γ和iNOS。此外,我们还使用Elisa方法检测BDNF的含量。为研究小胶质细胞对多巴胺能神经元是否有直接保护作用,我们将SH-SY5Y细胞与BV2小胶质细胞共培养,使用MTT方法测定了MPP+诱导的细胞毒性。研究结果:CSF1R抑制剂PLX3397可以在MPTP诱导的PD小鼠模型中有效的删除小胶质细胞。删除小胶质细胞加剧了MPTP导致的运动功能的损伤和多巴胺能神经元的丧失。而且,小胶质细胞的删除增加了脑内炎性介质的产生和外周免疫细胞的浸润。在淋巴细胞缺失小鼠中,小胶质细胞删除同样加重了MPTP所致的运动功能丧失和多巴胺神经元损伤。此外,小胶质细胞的删除并不影响脑源性神经营养因子（BDNF）的产生,但是星形胶质细胞的炎症介质的产生则显着增加。离体实验的结果表明BV2小胶质细胞不能直接减弱MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤,提示小胶质细胞无法直接减轻MPP+诱导的神经毒性损伤。研究结论:我们的结果表明小胶质细胞对MPTP诱导的神经炎症和多巴胺能神经毒性损伤具有保护作用。
二、Survival and differentiation of transplanted neural stem cells in mice brain with MPTP-induced Parkinson disease（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Survival and differentiation of transplanted neural stem cells in mice brain with MPTP-induced Parkinson disease（论文提纲范文）
（1）iPSCs-iGABA能神经元前体定向移植帕金森大鼠修复效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A 缩略词表 |
| 附录 B 个人简历 |
| 附录 C 综述 诱导多能干细胞在神经退行性疾病研究与治疗中的应用前景 |
| 参考文献 |
（2）新结构化合物生物碱异黄酮LY01和外泌体抗帕金森病的疗效及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蒙医“白脉病”与现代医学神经系统疾病的联系 |
| 1.1.1 蒙医“白脉”理论概述 |
| 1.1.2 蒙医对白脉病的认识 |
| 1.1.3 白脉病与现代医学神经系统疾病的联系 |
| 1.1.4 白脉病与帕金森病的联系 |
| 1.2 帕金森病研究进展 |
| 1.2.1 帕金森病概述 |
| 1.2.2 帕金森病的临床症状 |
| 1.2.3 帕金森病的病理特征 |
| 1.2.4 帕金森病的影响因素 |
| 1.2.5 帕金森病的诊断 |
| 1.2.6 帕金森病的发病机制 |
| 1.2.7 帕金森病的治疗 |
| 1.3 外泌体在帕金森病研究中的进展 |
| 1.3.1 外泌体概述 |
| 1.3.2 外泌体与神经退行性疾病 |
| 1.3.3 外泌体参与帕金森发病 |
| 1.3.4 外泌体作为帕金森病的生物标志物 |
| 1.3.5 外泌体的治疗作用 |
| 1.4 嘎顺-包日其格在传统医学中的应用及其现代药学研究 |
| 1.4.1 传统医学应用 |
| 1.4.2 现代药物化学研究 |
| 1.4.3 现代药理学研究 |
| 1.4.4 研究意义 |
| 1.4.5 新化合物 |
| 第二章 LY01对帕金森病模型小鼠的神经保护作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 动物在体给药 |
| 2.2.2 转棒测试 |
| 2.2.3 收取样本 |
| 2.2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.2.5 免疫荧光染色 |
| 2.2.6 组织总蛋白提取 |
| 2.2.7 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 组织RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 超氧化物歧化酶和丙二醛含量测定 |
| 2.2.11 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 LY01改善帕金森病模型小鼠运动能力 |
| 2.3.2 LY01减少帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元丢失 |
| 2.3.3 LY01减轻帕金森病模型小鼠黑质致密部和纹状体组织的神经炎症 |
| 2.3.4 LY01减轻帕金森病模型小鼠的氧化应激损伤 |
| 2.3.5 LY01减少帕金森病模型小鼠的黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 LY01对帕金森病模型细胞的保护作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 建立帕金森病细胞模型 |
| 3.2.3 MTT检测细胞活力 |
| 3.2.4 细胞总蛋白的提取 |
| 3.2.5 细胞总抗氧化能力、超氧化物歧化酶和丙二醛含量测定 |
| 3.2.6 建立炎症细胞模型 |
| 3.2.7 细胞RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 3.2.8 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 LY01增加PD模型细胞的活力 |
| 3.3.2 LY01减轻PD模型细胞的氧化应激损伤 |
| 3.3.3 LY01减轻LPS诱导的BV2细胞的神经炎症 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 LY01对帕金森病模型小鼠外泌体的调节作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 提取血清外泌体 |
| 4.2.2 外泌体处理 |
| 4.2.3 色谱质谱采集条件 |
| 4.2.4 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鉴定血清外泌体形态、粒径和浓度 |
| 4.3.2 帕金森病模型小鼠与正常小鼠之间差异表达的代谢产物 |
| 4.3.3 LY01对帕金森病模型小鼠血清外泌体中代谢物的影响 |
| 4.3.4 LY01调控差异代谢物统计及分析 |
| 4.3.5 LY01调控差异代谢物KEGG分类及富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 外泌体对帕金森病模型小鼠的神经保护作用及机制研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 采集健康志愿者血清外泌体 |
| 5.2.2 外泌体蛋白定量(microBCA法) |
| 5.2.3 动物给药 |
| 5.2.4 免疫组织化学染色 |
| 5.2.5 免疫荧光染色 |
| 5.2.6 组织总蛋白提取和蛋白浓度测定 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 组织RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 5.2.9 超氧化物歧化酶和丙二醛含量测定 |
| 5.2.10 统计学处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 血清外泌体对PD模型小鼠运动能力的影响 |
| 5.3.2 血清外泌体对PD模型小鼠多巴胺神经元的影响 |
| 5.3.3 血清外泌体调节黑质致密部和纹状体组织中炎症和抗炎因子的mRNA水平 |
| 5.3.4 血清外泌体减轻PD模型小鼠氧化应激损伤 |
| 5.3.5 血清外泌体调节PD模型小鼠黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白 |
| 5.3.6 血清外泌体代谢物作为PD的潜在生物标志物 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（3）苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠不同脑区GDNF-PI3K通路的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要实验试剂配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 实验动物造模 |
| 2.3 实验动物给药 |
| 2.4 实验动物行为学观察 |
| 2.5 实验动物取材与处理 |
| 3 实验动物指标检测 |
| 3.1 HE染色法观察不同脑区组织形态学变化 |
| 3.2 IHC法观察不同脑区GDNF-PI3K信号通路的表达 |
| 3.3 WB法检测不同脑区GDNF-PI3K信号通路相关蛋白的表达 |
| 4 统计分析 |
| 结果 |
| 1 造模结果 |
| 2 行为学检测结果 |
| 2.1 悬挂试验结果比较 |
| 2.2 步幅试验结果比较 |
| 3 HE染色变化 |
| 3.1 各组大鼠纹状体HE染色变化 |
| 3.2 各组大鼠前额叶皮层HE染色变化 |
| 4 各组大鼠不同脑区GDNF、PTEN免疫组化染色变化 |
| 4.1 各组大鼠纹状体GDNF、PTEN免疫组化染色变化 |
| 4.2 各组大鼠前额叶皮层GDNF、PTEN免疫组化染色变化 |
| 5 各组大鼠不同脑区相关蛋白表达变化 |
| 5.1 各组大鼠纹状体GDNF-PI3K通路相关蛋白表达变化 |
| 5.2 各组大鼠前额叶皮层GDNF-PI3K通路相关蛋白表达变化 |
| 讨论 |
| 1 帕金森病模型的建立与评价 |
| 1.1 帕金森病模型的建立 |
| 1.2 帕金森病模型的评价 |
| 2 GDNF-PI3K信号转导通路与帕金森病 |
| 2.1 GDNF-PI3K信号转导通路 |
| 2.2 GDNF与帕金森病 |
| 3 纹状体与额叶在帕金森病中的作用 |
| 3.1 纹状体在帕金森病发病中的作用 |
| 3.2 前额叶皮层在帕金森病发病中的作用 |
| 4 祖国传统医学对帕金森病的认识 |
| 5 苁蓉舒痉颗粒对帕金森病的神经保护作用 |
| 6 本研究的创新与存在的不足 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胶质源性神经营养因子神经保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）帕金森病靶向输递体系用于基因-化药协同治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 帕金森病简介 |
| 1.1.1 帕金森病病理特征 |
| 1.1.2 帕金森病基因治疗 |
| 1.1.3 帕金森病药物治疗 |
| 1.1.4 姜黄素药物治疗 |
| 1.2 帕金森病药物输递体系瓶颈 |
| 1.2.1 siRNA药物 |
| 1.2.2 siRNA药物递送材料 |
| 1.2.3 化学药物特点 |
| 1.2.4 化学药物递送材料 |
| 1.3 帕金森病药物输递体系设计方法 |
| 1.3.1 长循环特性纳米颗粒 |
| 1.3.2 共包载纳米颗粒 |
| 1.3.3 表面靶向效应纳米材料 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 1.4.1 论文立题依据 |
| 1.4.2 论文研究目标及策略 |
| 第2章 CT可视化金纳米颗粒联合递送体系构建和体外评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验材料与样品 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 聚合物材料的合成 |
| 2.2.4 金纳米颗粒的制备与表征 |
| 2.2.5 CT可视化靶向纳米药物载体MBPCS的组装 |
| 2.2.6 CT可视化靶向纳米药物载体MBPCS的理化表征 |
| 2.2.7 MBPCS环境响应特性 |
| 2.2.8 MBPCS生物相容性检测 |
| 2.2.9 MBPCS纳米药物细胞水平药物摄取 |
| 2.2.10 MBPCS纳米药物细胞水平药效评价 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 聚合物材料的表征 |
| 2.3.2 金纳米颗粒的制备与表征 |
| 2.3.3 CT可视化靶向纳米药物载体MBPCS的理化表征 |
| 2.3.4 MBPCS环境响应特性 |
| 2.3.5 MBPCS生物相容性检测 |
| 2.3.6 MBPCS纳米药物细胞水平药物摄取 |
| 2.3.7 MBPCS纳米药物细胞水平药效评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 CT可视化金纳米颗粒联合递送体系治疗帕金森病体内评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验材料与样品 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 帕金森病动物模型构建 |
| 3.2.4 MBPCS纳米药物在帕金森病动物脑部富集评价 |
| 3.2.5 MBPCS纳米药物动物水平CT成像评价 |
| 3.2.6 MBPCS纳米药物动物水平治疗评价 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 帕金森病动物模型构建 |
| 3.3.2 MBPCS纳米药物在帕金森病动物脑部富集评价 |
| 3.3.3 MBPCS纳米药物动物水平CT成像评价 |
| 3.3.4 MBPCS纳米粒子动物水平治疗评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 外泌体涂层聚合物杂化联合递送体系构建和体外治疗评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验材料与样品 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 基因-化药内核C/ANP/S的制备和表征 |
| 4.2.4 imDC EXO的制备及其RVG修饰 |
| 4.2.5 REXO-C/ANP/S的理化表征 |
| 4.2.6 REXO-C/ANP/S的内吞 |
| 4.2.7 REXO-C/ANP/S细胞水平病理抑制效果评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基因-化药内核C/ANP/S的制备和表征 |
| 4.3.2 imDC EXO的制备及其RVG修饰 |
| 4.3.3 REXO-C/ANP/S的理化表征 |
| 4.3.4 REXO-C/ANP/S的内吞 |
| 4.3.5 REXO-C/ANP/S细胞水平病理抑制效果评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 外泌体涂层聚合物杂化联合递送体系体内治疗和免疫研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验材料与样品 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 药物体内分布观察 |
| 5.2.4 帕金森病小鼠模型治疗行为学评价 |
| 5.2.5 帕金森病大鼠模型治疗行为学评价 |
| 5.2.6 帕金森病非人灵长类动物模型治疗行为学评价 |
| 5.2.7 病理改善评价 |
| 5.2.8 免疫学初探 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 药物体内分布观察 |
| 5.3.2 帕金森病小鼠模型治疗行为学评价 |
| 5.3.3 帕金森病大鼠模型治疗行为学评价 |
| 5.3.4 帕金森病非人灵长类动物模型治疗行为学评价 |
| 5.3.5 病理改善评价 |
| 5.3.6 免疫学初探 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 创新点总结 |
| 6.2 今后工作建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠模型的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化中lncRNAs的差异表达及lncRNA MIAT的调节作用 |
| 前言 |
| 第一节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化体系的建立 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. hiPSCs的细胞培养与多能性鉴定 |
| 2. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程和细胞形态 |
| 3. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关基因表达 |
| 4. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关标志物的免疫荧光染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化过程中lncRNAs的表达变化和功能分析 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 测序样本总RNA的质量检测 |
| 2. LncRNAs测序数据质量评估 |
| 3. 比对分析结果 |
| 4. 表达量分析结果 |
| 5. 差异基因表达与验证 |
| 6. 差异基因聚类 |
| 7. 差异表达mRNAs的富集分析结果 |
| 8. LncRNAs co-expression靶基因预测与功能分析 |
| 9. LncRNAs co-location靶基因预测与功能分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 LncRNA MIAT调节hiPSCs的神经分化 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA MIAT与共表达靶基因KEGG通路分析与验证 |
| 2. 成功构建转录激活过表达lncRNA MIAT的hiPSCs细胞系 |
| 3. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs多能性的影响 |
| 4. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs向DA能神经元诱导分化的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 6-OHDA大鼠帕金森模型的建立和不同脑区的转录组分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 6-OHDA大鼠PD模型的损伤程度 |
| 2. 测序样本总RNAs的质量检测 |
| 3. mRNAs测序数据质量评估 |
| 4. 比对分析结果 |
| 5. 5个脑区的表达量分析结果 |
| 6. 5个脑区的差异表达基因(DEGs)与验证 |
| 7. 5个脑区的差异基因聚类分析与韦恩分析 |
| 8. 5个脑区的差异基因富集分析 |
| 9. 5个脑区的PPI分析与验证 |
| 10. KEGG分析关键信号通路的验证 |
| 11. 6-OHDA大鼠PD模型5个脑区的线粒体超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 干细胞移植治疗6-OHDA大鼠帕金森模型的效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 干细胞鉴定 |
| 2. APO诱导旋转测试不同类型干细胞移植治疗的行为学效果评价 |
| 3. 旷场试验和抓力测试 |
| 4. 移植细胞在脑内的存活、迁移、增殖和分化 |
| 5. 细胞移植后星形胶质细胞的表达 |
| 6. 细胞移植后超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 PTRF转基因小鼠中造血干细胞的功能受损 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. PTRF的表达随年龄增长而增加并促进髓系分化 |
| 2. PTRF过表达耗损HSCs |
| 3. PTRF过表达损伤HSCs的功能 |
| 4. PTRF诱导HSCs衰老 |
| 5. PTRF通过Cav-1激活了HSCs的衰老通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在神经发育和帕金森病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 hiPSCs质检报告(赛贝公司) |
| 附件2 表5-1 iPSCd0组与iPSCd7组转录本水平差异显着的lncRNAs |
| 附件3 表5-2 iPSCd0组与iPSCd7组基因水平差异显着的mRNAs |
| 附件4 表5-3模型组与对照组在OB区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件5 表5-4模型组与对照组在SVZ区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件6 表5-5模型组与对照组在Str区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件7 表5-6模型组与对照组在SN区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件8 表5-7模型组与对照组在Hippo区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）PDGF-BB对PD模型中神经细胞的保护作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 帕金森疾病的病理机制 |
| 1.1.1 帕金森疾病与氧化应激 |
| 1.2 帕金森疾病治疗现状 |
| 1.3 PDGF-BB简介及其在帕金森疾病中的研究进展 |
| 1.4 MPP~+/MPTP构建PD实验模型 |
| 1.4.1 MPP~+构建PD的细胞模型 |
| 1.4.2 MPTP构建PD实验动物模型 |
| 1.5 PDGF-BB激活的下游相关信号通路 |
| 1.5.1 PI3K/AKT/GSK-3β信号通路 |
| 1.5.2 MAPK信号通路 |
| 1.6 cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和酪氨酸羟化酶 |
| 1.7 研究意义及贡献 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.2 SH-SY5Y细胞培养 |
| 2.1.3 原代神经元细胞培养 |
| 2.2 细胞活力和细胞死亡测定 |
| 2.2.1 实验材料及仪器 |
| 2.2.2 细胞活力测定 |
| 2.2.3 细胞死亡测定 |
| 2.3 活性氧检测分析 |
| 2.3.1 实验材料及仪器 |
| 2.3.2 活性氧测定 |
| 2.4 PD动物模型建立与行为学评估 |
| 2.4.1 实验材料及仪器 |
| 2.4.2 PD小鼠模型建立 |
| 2.5 PD动物给药 |
| 2.5.1 实验材料及仪器 |
| 2.5.2 PD动物给药 |
| 2.6 动物脑组织取材 |
| 2.6.1 实验材料及仪器 |
| 2.6.2 小鼠脑组织取材 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.7.1 实验材料及仪器 |
| 2.7.2 蛋白提取 |
| 2.7.3 BCA定量 |
| 2.7.4 Western Blot |
| 2.8 RNA提取与q-PCR |
| 2.8.1 实验材料及仪器 |
| 2.8.2 RNA提取 |
| 2.8.3 cDNA合成 |
| 2.8.4.q-PCR |
| 2.9 si-RNA转染 |
| 2.9.1 实验材料 |
| 2.9.2 si-RNA转染 |
| 2.10 细胞免疫荧光 |
| 2.10.1 实验材料及仪器 |
| 2.10.2 细胞免疫荧光 |
| 2.11 统计学方法 |
| 2.12 本章小结 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 PDGF-BB对MPP~+的细胞毒作用具有明显的保护作用 |
| 3.2 PDGF-BB抑制MPP~+诱导的ROS生成 |
| 3.3 PDGF-BB处理激活PI3K/Akt/GSK-3β 和MEK/ERK信号通路 |
| 3.4 PDGF-BB降低MPP~+对Akt/GSK-3β 和MEK/ERK通路的抑制作用 |
| 3.5 Akt/GSK-3β 和MEK/ERK通路参与PDGF-BB介导的神经保护作用 |
| 3.6 PDGF-BB促进转录因子CREB的活化 |
| 3.7 转录因子CREB参与PDGF-BB介导的细胞保护功能 |
| 3.8 PDGF-BB促进PD动物模型中TH的表达 |
| 3.9 本章小结 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（7）HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 HTRA2/OMI沉默在PD细胞模型中对DA神经元凋亡的机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 细胞实验方法 |
| 1.3 HtrA2/Omi基因沉默实验 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 HTRA2/OMI功能抑制在PD模型中对DA神经元凋亡的机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 实验条件 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 WNT信号通路功能改变与PD模型细胞凋亡的相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 实验条件 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植促进PD大鼠神经功能修复及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 动物准备 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验试剂及实验仪器 |
| 1.3 大鼠PD模型制备 |
| 2 细胞培养及鉴定 |
| 2.1 细胞实验试剂及实验仪器 |
| 2.2 NSCs的培养、鉴定与分化 |
| 2.3 OECs的培养与鉴定 |
| 3 细胞移植 |
| 3.1 实验试剂来源 |
| 3.2 细胞准备 |
| 3.3 移植手术 |
| 4 大鼠行为学及焦虑程度测试 |
| 4.1 实验仪器 |
| 4.2 旷场试验 |
| 4.3 平衡木测试 |
| 4.4 握力测试 |
| 5 移植后NSCs和 OECs的检测 |
| 5.1 实验试剂及实验仪器 |
| 5.2 组织样品预处理及荧光观察 |
| 6 大鼠Str和 SN中 TH和 Str中炎性因子TNF-α,IL-1β及 IL-4 的表达变化 |
| 6.1 实验试剂及实验仪器 |
| 6.2 组织蛋白提取与Western blot |
| 7 技术路线图 |
| 8 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 细胞体外培养及鉴定 |
| 1.1 NSCs体外培养及分化 |
| 1.2 OECs体外培养 |
| 1.3 NSCs鉴定与分化 |
| 1.4 OECs的鉴定 |
| 2 移植前细胞标记及移植后检测 |
| 2.1 移植前细胞标记 |
| 2.2 移植后检测 |
| 3 大鼠运动行为学实验结果 |
| 3.1 旷场试验结果 |
| 3.2 平衡木测试结果 |
| 3.3 握力测试结果 |
| 4 大鼠焦虑程度 |
| 5 大鼠Str及 SN中 TH的表达变化 |
| 6 大鼠Str中炎性因子TNF-α,IL-1β及 IL-4 的表达变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）人脂肪间充质干细胞介导VEGF189抑制TRPV1缓解帕金森小鼠疼痛的实验研究（论文提纲范文）
| 华中科技大学博士学位论文创新点概述 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 帕金森病小鼠模型制作及疼痛行为学评估 |
| 引言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 图表 |
| 第二部分 TRPV1在帕金森模型小鼠疼痛发生中的机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 图表 |
| 第三部分 hAMSCs-VEGF的构建及其治疗 PD 小鼠疼痛的效果评估 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 图表 |
| 综述 TRP家族在帕金森病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要缩略词 |
| 附录2 攻读博士期间以第一作者发表的论文 |
| 致谢 |
（10）小胶质细胞在MPTP诱导的多巴胺神经元死亡中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.对象和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 小胶质细胞删除模型和小鼠 MPTP 模型 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 行为学功能评估 |
| 1.5 免疫组化染色 |
| 1.6 免疫荧光染色 |
| 1.7 流式细胞术检测中枢免疫 |
| 1.8 实时反转录PCR(Real-time Reverse Transcription Polymerase ChainReaction, 实时反转录聚合聚合酶链反应) |
| 1.9 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 1.10 细胞培养和细胞毒性测试 |
| 1.11 统计 |
| 2.结果 |
| 2.1 PLX3397 删除了MPTP处理的小鼠中的小胶质细胞 |
| 2.2 小胶质细胞的删除加重MPTP小鼠的运动缺陷和多巴胺能神经元的丢失 |
| 2.3 小胶质细胞的删除促进白细胞浸润和局部炎症 |
| 2.4 小胶质细胞删除增强MPTP诱导的多巴胺能神经毒性的结果并不完全依赖于淋巴细胞 |
| 2.5 小胶质细胞删除不会显着改变MPTP小鼠中BDNF的表达 |
| 2.6 小胶质细胞删除增加了MPTP诱导的星形胶质细胞反应 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 帕金森病进程中的小胶质细胞反应 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Survival and differentiation of transplanted neural stem cells in mice brain with MPTP-induced Parkinson disease（论文参考文献）
- [1]iPSCs-iGABA能神经元前体定向移植帕金森大鼠修复效应研究[D]. 朱缓. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [2]新结构化合物生物碱异黄酮LY01和外泌体抗帕金森病的疗效及分子机制研究[D]. 孙婷. 中央民族大学, 2021(10)
- [3]苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠不同脑区GDNF-PI3K通路的影响[D]. 林昱. 福建中医药大学, 2020(04)
- [4]帕金森病靶向输递体系用于基因-化药协同治疗的研究[D]. 刘霖颖. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2020(01)
- [5]LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究[D]. 吕颖. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]PDGF-BB对PD模型中神经细胞的保护作用及相关机制研究[D]. 陈欢. 电子科技大学, 2020(07)
- [7]HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究[D]. 李艳霞. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]神经干细胞和嗅鞘细胞联合移植促进PD大鼠神经功能修复及机制研究[D]. 周囡囡. 青岛大学, 2019(03)
- [9]人脂肪间充质干细胞介导VEGF189抑制TRPV1缓解帕金森小鼠疼痛的实验研究[D]. 李曼. 华中科技大学, 2019(01)
- [10]小胶质细胞在MPTP诱导的多巴胺神经元死亡中的作用及机制[D]. 杨晓霞. 天津医科大学, 2019(02)