一、逆转录病毒介导HSVtk基因转导体外抗结肠癌的作用（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中研究指明癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
鲁玉凡[2]（2021）在《复方苦参注液射增效顺铂抗p53突变型结肠癌作用及机制研究》文中研究表明选题依据:结肠癌是最常见的恶性肿瘤,其主要治疗策略是手术辅以化疗,但化疗过程中耐药性的产生使得治疗失败。P53突变介导的化疗耐药是结肠癌耐药的主要机制之一。因此,发掘一种临床药物,克服p53突变介导的化疗耐药,提高结肠癌的治疗成功率,将极大缩短新药的研发周期及成本,对于结肠癌的治疗意义重大。复方苦参注射液（Compound Kushen Injection,CKI）是临床治疗结肠癌的辅助用药中使用率位居首位的中成药,与顺铂类和5氟尿嘧啶类药物联合应用的频次高达45.34%和40.90%。然而,尚未有文献报道CKI的辅助治疗效果与p53突变的关系。因此,本文拟研究CKI对顺铂和5氟尿嘧啶抗p53突变型结肠癌活性的影响,并探讨其作用机制,以期建立一种抗p53突变型结肠癌的治疗策略。方法及结果:1.基于两株结肠癌细胞——HCT116和SW480细胞(p53野生型HCT116细胞和p53R273H/P309S突变型SW480细胞株),采用磺酰罗丹明B染色法研究CKI对顺铂（Cis）和5氟尿嘧啶（5FU）体外抗结肠癌活性的影响,并通过combenefit软件评价药物联用的协同/拮抗效应。结果表明,CKI增强Cis抗HCT116和SW480细胞生长,减弱5FU抗HCT116细胞生长,增强5FU抗SW480细胞生长,其中CKI对Cis抗SW480细胞生长的增强作用最大,表明CKI选择性增效Cis抗SW480细胞生长。2.基于HCT116是p53野生型细胞,SW480细胞携带p53 R273H/P309S突变,采用慢病毒转染技术构建HCT116(p53-/-)p53WT和HCT116(p53-/-)p53 R273H/P309S细胞株,检测CKI和Cis（或5FU）联用对这两株细胞的体外抗肿瘤活性。结果表明,CKI对Cis抗HCT116(p53-/-)p53WT细胞生长的活性没有影响,增强Cis抗HCT116(p53-/-)p53R273H/P309S细胞生长,减弱5FU抗HCT116(p53-/-)p53WT和HCT116(p53-/-)p53 R273H/P309S细胞生长。综上结果表明,CKI选择性增效Cis抗p53突变型结肠癌。3.为了探索CKI选择性增效Cis抗p53突变型结肠癌细胞的作用机制,采用转录组学技术评价CKI、Cis和5FU单用和联用对SW480细胞转录组学的影响。结果表明,CKI重编Cis对SW480细胞转录组的调节作用,而对5FU的影响较弱。4.基于细胞因子-细胞因子受体相互作用途径（Cytokine-Cytokine receptor interaction）是CKI联用Cis显着调节的生物学过程,采用western blot对该途径中与肿瘤发生和治疗密切相关的TRAIL通路的关键蛋白进行验证。结果显示,Cis诱导RIPK1的表达,表明Cis诱导SW480细胞发生坏死性凋亡;CKI增强Cis处理组中DR5和caspase-3的表达,诱导PARP的剪切,表明CKI增效Cis诱导SW480细胞凋亡的发生。此外,细胞凋亡和坏死性凋亡抑制剂显着减弱CKI联用Cis诱导的SW480细胞死亡,表明CKI依赖于诱导细胞凋亡增效Cis抗SW480细胞生长。综上结果,CKI选择性增效顺铂抗p53突变型结肠癌细胞生长,其作用机制可能为:CKI增加Cis处理细胞中死亡受体DR5表达,诱导凋亡蛋白caspase-3表达增加,激活细胞凋亡,增强Cis的抗肿瘤活性。本研究为靶向治疗p53突变型结肠癌提供了思路,也为CKI的临床精准应用提供了指导。
杜华珊[3]（2021）在《STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究》文中提出研究背景:宫颈癌是最常见的妇科癌症之一。每年全球大约有57万新发病例,31万死亡病例。大约95%的宫颈癌病例是由高危人类乳头瘤病毒（HPV）的持续感染引起的。尽管已有预防高危型HPV的疫苗,宫颈癌对妇女来说仍然是一场健康危机。因此,有必要为宫颈癌的预防和治疗提供新的视角。干扰素基因刺激因子（STING）是一种跨膜蛋白,是细胞质DNA传感通路的重要分子。越来越多的证据表明,STING通路除了能保护宿主免受多种致病性攻击外,在癌症中也起着至关重要的作用。在结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤中,与抗肿瘤T细胞启动和I型干扰素相关的STING信号被严重抑制以逃避免疫监视。STING在胃癌组织中低表达,与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴转移、临床病理分期和生存率有关。敲除STING可促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。此外,多项研究表明,STING激动剂可以作为单药或联合手术治疗、放化疗、免疫治疗发挥抗肿瘤作用,弥补传统疗法的不足。研究目的:目前,尚不清楚STING在宫颈癌发生发展过程中的具体作用。本研究检测了人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中STING的表达情况。通过构建沉默STING和过表达STING的稳定转染宫颈癌细胞系,进行细胞生物学行为实验探讨STING对于宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响和相关调控机制。此外,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型进行体内实验对体外实验的结果进行验证,为宫颈癌预防和宫颈癌复发或转移的治疗提供新的思路。研究方法:第1部分:STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验1、通过qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验检测体外培养的人角质形成细胞Ha Ca T、宫颈上皮永生化细胞H8、四种宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、C33A、Ca Ski）的STING m RNA和蛋白表达情况;2、构建沉默STING的sh RNA慢病毒载体。选择He La、Si Ha细胞系作为沉默STING的转染细胞系。设计构建STING基因的过表达慢病毒载体,转染C33A细胞系。鉴定稳定转染细胞系中STING的表达情况;3、通过CCK8实验、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验探究STING对于宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。第2部分:STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索1、下调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;2、上调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;3、应用免疫共沉淀实验检测STING是否与β-catenin结合;4、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;5、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,通过CCK8实验、平板克隆实验和Transwell小室实验探究下调STING表达对宫颈癌生物学行为的影响能否被β-catenin通路抑制剂所逆转。第3部分:沉默STING对宫颈癌细胞增殖能力影响的体内实验1、使用vector He La、sh STING-He La细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,探究移植瘤沉默STING对裸鼠体重影响;2、通过测量裸鼠移植瘤体积和绘制肿瘤生长曲线验证下调STING表达对于宫颈癌细胞体内增殖能力的影响;3、肿瘤组织进行HE染色,探究下调STING表达是否影响肿瘤组织病理形态;4、肿瘤组织进行免疫组化染色,验证沉默STING的He La细胞在体内成瘤后是否仍保持沉默STING的特征;5、通过免疫组化染色Ki67探究沉默STING对于移植瘤增殖能力的影响。研究结果:第1部分:1、qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验显示在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞、4种宫颈癌细胞系中STING表达水平有差异。与正常细胞相比,HPV阴性宫颈癌细胞系C33A中的STING表达降低,其余三种HPV阳性宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、Ca Ski）STING表达升高;2、成功合成了靶向STING的sh RNA并筛选出干扰效率最高的sh RNA片段。成功构建并验证沉默STING基因的He La和Si Ha稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。STING过表达慢病毒载体构建成功,成功构建并验证过表达STING基因的C33A稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异;3、STING表达下调后,He La及Si Ha细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力增强。过表达STING基因后,C33A细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力明显下降。第2部分:1、沉默STING后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显增加,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之升高;2、STING过表达后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显减少,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之明显降低;3、免疫共沉淀实验显示内源性STING可与β-catenin结合;4、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂,显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平与单纯沉默STING组比较明显降低;5、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂显示细胞体外增殖速度、克隆形成能力、迁移和侵袭的能力明显低于单纯沉默STING组。第3部分:1、裸鼠接种移植瘤后,sh STING-He La组裸鼠体重呈低于vector-He La组趋势,但趋势无统计学意义;2、sh STING-He La组肿瘤体积和生长速度明显大于对照组;3、HE染色显示vector-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;sh STING-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、血管组织较丰富;4、免疫组化染色显示体外构建的sh STING-He La细胞系成瘤后,STING低水平表达特征保留;5、免疫组化染色显示sh STING-He La组Ki67表达水平高于vector He La组Ki67表达水平。研究结论:1、不同类型的宫颈癌细胞STING表达水平不同,但STING的细胞生物学作用相同。STING可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭,在宫颈癌的发生发展中起抑癌基因作用;2、STING下调宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路中总β-catenin蛋白、活化β-catenin蛋白、核β-catenin蛋白以及Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）蛋白表达水平;3、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白质的表达上调。4、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的上调。5、STING通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌的发生发展。6、沉默STING对宫颈癌细胞体内增殖能力有促进作用。
张志宏[4]（2021）在《锌指蛋白70在结肠炎相关结直肠癌发生发展及铃兰毒苷抗结直肠癌作用机制研究》文中进行了进一步梳理背景:IL-1β是关键的促炎介质,对局部和全身炎症至关重要。NLRP3炎性小体及STAT3激活可促进巨噬细胞中IL-1β分泌。IL-1β等促炎因子可以促进炎症相关的癌症。STAT3的异常激活可促进结直肠癌细胞的存活,细胞增殖,迁移,侵袭和血管生成。ZNF70是锌指蛋白家族的成员,与癌症也有密切的联系。三萜类化合物铃兰毒苷具有抗癌的药理活性。目的:（1）本文探究锌指蛋白70ZNF70)是否通过调控THP-1巨噬细胞中NLRP3炎性小体和STAT3激活从而促进炎症相关结直肠癌发生发展。（2）本文探究铃兰毒苷是否通过调节结肠癌细胞中STAT3激活从而抑制结直肠癌的发生发展。方法:（1）在体外实验中,通过ELISA,RT-PCR,蛋白免疫印迹实验,免疫共沉淀,Duolink PLA技术检测,免疫荧光,EdU标记测定和集落形成实验研究ZNF70对上调THP-1巨噬细胞IL-1β分泌到促进HCT116细胞增殖的作用及潜在机制。在体内实验中,将AAV介导的ZNF70基因沉默遗传方法与AOM/DSS模型相结合探究ZNF70对结肠炎相关结直肠癌的影响。（2）在体外实验中,通过分子对接,荧光素酶报告基因实验,MTT测定,RT-PCR,蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验探究铃兰毒苷对HCT116细胞中STAT3活化的潜在机制。通过EdU标记测定,集落形成实验,流式细胞术,划痕实验,基质胶侵袭实验和小管形成实验探究铃兰毒苷对人结直肠癌HCT116细胞增殖,凋亡及人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移,侵袭和血管生成的影响。在体内实验中,将裸鼠移植瘤模型与免疫组织化学染色实验相结合检测铃兰毒苷的抗肿瘤活性。结果:（1）在LPS和ATP诱导的THP-1细胞中,我们发现ZNF70可激活NLRP3炎性小体,进而促进IL-1β分泌。有趣的是,我们发现ZNF70的Zn F结构域可以与NLRP3相互作用,并通过特异性抑制NLRP3上K48泛素链连接的泛素从而抑制NLRP3的泛素化。此外,ZNF70通过促进Src/STAT3信号通路从而促进Pro-IL-1β的表达。值得注意的是,我们发现ZNF70是巨噬细胞与结肠癌细胞之间连接的靶标。在经LPS和ATP处理THP-1巨噬细胞上清液培养的HCT116细胞中,ZNF70通过促进STAT3激活促进HCT116细胞增殖。ZNF70敲低可改善AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌肿瘤的生长,抑制小鼠结肠组织中Pro-IL-1β,NLRP3炎性小体,p-STAT3（T705）,Ki67和F4/80蛋白水平表达并且抑制小鼠血清中IL-1β的分泌,进一步证实了体外观察。（2）铃兰毒苷抑制结肠癌细胞SW620和HCT116的细胞存活率。在HCT116细胞中,铃兰毒苷通过JAK1,JAK2和Src途径抑制STAT3在705位的酪氨酸发生磷酸化,并通过PI3K-AKT-mTOR-STAT3途径抑制STAT3在727位的丝氨酸发生磷酸化。有趣的是,我们在mTOR/STAT3和JAK/STAT3通路中发现mTOR和JAK2之间可发生相互串扰,共同调节STAT3激活,并且铃兰毒苷在其中扮演重要的角色。铃兰毒苷抑制涉及细胞存活（例如Survivin,Bcl-xl,Bcl-2）,增殖（例如Cyclin D1）,转移（例如MMP-9）和血管生成（例如VEGF）靶基因的表达。我们发现铃兰毒苷抑制内皮细胞的小管形成,迁移和侵袭,并抑制结肠癌细胞增殖。最后,铃兰毒苷对裸鼠移植瘤模型中肿瘤的抑制作用进一步证实了体外观察。结论:（1）ZNF70通过干预巨噬细胞中NLRP3炎性小体和STAT3信号通路从而促进HCT116增殖,并提示ZNF70可能是干预炎症相关结直肠癌有希望的治疗靶标。（2）目前的研究结果表明,在结直肠癌中,铃兰毒苷通过干预JAK2/STAT3（T705）和mTOR/STAT3（S727）信号传导通路之间的串扰,可促进细胞凋亡,并抑制增殖和血管生成,表明铃兰毒苷可能是结直肠癌治疗有价值的候选物。
王枭杰[5]（2021）在《低浓度地西他滨促HT29结肠癌细胞增殖和机制研究》文中进行了进一步梳理目的:明确地西他滨（DAC）促进结肠癌细胞HT29增殖的药物浓度以及该浓度对HT29细胞增殖能力,细胞周期和细胞形态学的影响。材料与方法:选择HT29人源结肠癌细胞系。根据是否采用DAC处理分两组:（1）DAC处理组:含不同终浓度DAC(10-3至100μM)的DMEM培养基处理的HT29结肠癌细胞。（2）对照组:普通DMEM培养基培养的HT29结肠癌细胞。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法和细胞平板克隆形成实验检测细胞增殖水平。进一步选择终浓度0.1μM的DAC处理HT29肠癌细胞,计算相对细胞活力,绘制生长曲线。流式细胞术检测细胞周期,7-AAD和Annexin V-PE双染检测细胞凋亡。连续变量采用t检验、单因素方差分析或重复测量方差分析进行比较。使用Graph Pad Prism 7软件、R 3.5.1软件或SPSS 20.0软件进行分析。P值<0.05提示差异有统计学意义。结果:与对照组相比,在10-3至0.1μM浓度范围内,DAC促进HT29肠癌细胞的增殖,而在1至10μM浓度范围,DAC对HT29肠癌细胞的活力无影响,当浓度大于100μM时,DAC抑制HT29肠癌细胞增殖。进一步选择终浓度0.1μM的DAC处理HT29肠癌细胞,计算相对细胞活力,绘制生长曲线。与对照组相比,0.1μM的DAC促进HT29肠癌细胞增殖,至第5d,0.1μM DAC组的相对细胞活力为157.7%（P<0.05）。0.1μM DAC处理可增加HT29肠癌细胞的克隆形成能力,而1μM DAC轻度抑制HT29肠癌细胞的克隆形成能力。HT29肠癌细胞呈鹅卵石状,经0.1μM DAC处理48小时后,HT29肠癌细胞呈梭形,具有间充质细胞形态。0.1μM DAC处理使HT29肠癌细胞的S期细胞比例增加（DAC组比对照组:27.0%比14.7%,P<0.01）,而G1期细胞比例下降（DAC组比对照组:57.4%比67.6%,P<0.01）,提示低浓度DAC处理促进G1/S转换。低浓度DAC(范围:10-2至10μM)可轻度降低HT29肠癌细胞早期凋亡和总凋亡率。结论:低浓度DAC促进HT29肠癌细胞增殖及克隆形成、增加HT29肠癌细胞S期比例、轻度抑制HT29肠癌细胞凋亡、使HT29肠癌细胞获得间充质细胞形态。目的:从系统生物信息学角度探索DAC促HT29结肠癌细胞增殖的机制。材料与方法:从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载三组微阵列数据集（数据集编号GSE41364、GSE32323、GSE22598）,通过趋势聚类分析（Series test of cluster,STC）和加权共表达网络分析（Weighted gene coexpression network analysis,WGCNA）,探索随着DAC浓度变化（0μM、5μM和10μM）,HT29结肠癌细胞系的核心通路变化,接着通过基因集变异分析（Gene set variation analysis,GSVA）,拟合并评估不同DAC浓度处理下,HT29结肠癌细胞的这些信号通路的激活水平。最后综合运用多个数据集,初步验证这些核心通路的核心基因在转录水平的表达变化。结果:STC分析结果提示,随着DAC处理浓度的递增,其转录组基因转录水平变化趋势可归纳为8个趋势模式,总体转录水平呈上升趋势。选择其中P值最小的趋势（即“趋势6”,共包含2893个基因,P=3.7E-169）进一步行信号通路富集分析。WGCNA分析提示,共有6个模块与DAC治疗相关,纳入进一步分析。通过对WGCNA分析中与DAC处理存在强相关性的模块基因,以及趋势6数据集内的基因进行生物学过程、信号通路富集和分子功能富集分析。结果提示不同DAC处理HT29肠癌细胞可改变如下细胞功能和信号通路:（1）E2F介导的细胞周期蛋白E相关G1/S转换;（2）凋亡通路;（3）上皮-间质转化（EMT）途径的调控。采用GSVA分析不同浓度DAC（0μM、5μM和10μM）处理HT29结肠癌细胞后前述核心通路的活性变化。结果提示,5μM DAC使3条G1/S转换细胞周期相关通路活性增加,而随着DAC浓度增加（10μM）,活性被抑制;随着DAC浓度增加,EMT通路逐步轻度激活,而内源性凋亡通路活性逐渐下降。接着采用两个独立GEO数据集（GSE32323和GSE22598）验证DAC处理HT29结肠癌细胞组（单浓度或多浓度）和对照组之间核心信号通路上关键分子的转录组水平变化。结果提示DAC可不同程度上调E2F介导的细胞周期蛋白E相关G1/S转换、凋亡通路和EMT的关键分子的转录。结论:经DAC处理后,HT29结肠癌细胞系转录组基因转录水平呈上升趋势。共3条信号通路,包括E2F介导的细胞周期蛋白E相关G1/S转换、凋亡通路和EMT信号通路是不同浓度DAC（0μM、5μM和10μM）处理HT29结肠癌细胞后,细胞转录组水平发生变化的核心通路。目的:采用0.1μM DAC体外处理HT29结肠癌细胞,通过RT-PCR和Western blot在RNA和蛋白水平检测DAC处理后HT29细胞G1/S通路、内源性凋亡通路和EMT通路的关键基因的表达变化。材料与方法:选择终浓度0.1μM的DAC稳定培养HT29结肠癌细胞。采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测E2F1、E2F3、CCNE1、BCL2、PCNA、FOXC1、VIM、CXCL1、VCAM1的m RNA表达变化,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测Cyclin E1、PCNA、Bcl-2、Bax等蛋白的表达变化。连续变量的比较采用t检验。使用Graph Pad Prism 7软件、R 3.5.1软件或SPSS 20.0软件进行分析。P值<0.05提示差异有统计学意义。结果:（1）G1/S转换通路:RT-PCR提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞的E2F1、E2F3和CCNE1的m RNA表达,Western blot提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞Cyclin E1和PCNA蛋白的表达。（2）内源性凋亡通路:RT-PCR提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞的BCL2、PCNA和FOXC1的m RNA表达,Western blot提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞Bcl-2蛋白的表达,并抑制Bax蛋白的表达。（3）EMT通路:RT-PCR提示0.1μM DAC可上调HT29结肠癌细胞的VIM、CXCL1、VCAM1的m RNA表达。结论:体外实验证实低浓度DAC通过激活Cyclin E1激活HT29结肠癌细胞的G1/S转换通路;通过激活Bcl-2蛋白抑制HT29结肠癌细胞的内源性凋亡通路。目的:选择BCL2为例进行研究,对DAC的促癌效果提供新的理论解释。材料与方法:首先比较BCL2 m RNA在肿瘤基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）结肠癌数据集中癌和癌旁的表达情况,接着通过Oncomine在线数据库对结直肠癌组织和正常组织的BCL2 m RNA的差异表达情况进行meta分析,最后通过亚硫酸氢盐处理后测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测低浓度DAC处理后HT29结肠癌细胞的BCL2启动子区的甲基化水平变化。结果:基于TCGA数据库499例结肠癌的转录组数据,发现结肠癌中BCL2m RNA表达低于正常粘膜（14.4±1.1 vs.16.3±0.3,P<0.0001）。基于Oncomine数据库中19个结直肠癌数据集的转录组数据进行meta分析,进一步证实结直肠癌组织中BCL2 m RNA表达低于正常粘膜（P=2.27E-6）。对从MEXPRESS下载的BCL2在TCGA数据库结肠癌数据集中的原始表达矩阵、甲基化位点矩阵和临床信息进行整合,结果提示BCL2启动子区Cp G岛的12个甲基化位点在结肠癌组织中甲基化水平高于正常结肠粘膜组织。针对该BCL2启动子区的Cp G岛进行BSP检测。结果提示,在0.1μM DAC处理后,HT29结肠癌细胞的BCL2启动子区的DNA甲基化率低于对照组（41.1%对57.9%）。结论:BCL2 m RNA在结直肠癌组织中表达低于正常粘膜,启动子区甲基化水平高于正常粘膜。DAC处理HT29结肠癌细胞后其BCL2启动子区的甲基化水平下降。
韩玮[6]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
李勇芳[7]（2016）在《Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用》文中研究表明目的:1.构建一种由survivin启动子介导的重组载体pc DNA3.1-p Survivin-TK。2.检测由survivin启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVtk）自杀基因的真核表达载体pc DNA3.1-p Survivin-TK在肝癌细胞内是否能够特异性表达。3.研究由survivin启动子介导的HSVtk自杀基因联合更昔洛韦（GCV）对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:1.体外培养HL-7702人正常肝细胞、HEK293T人胚肾细胞、Hep G2及Hu H-7人肝癌细胞。2.提取Hep G2细胞的基因组DNA,PCR扩增survivin启动子序列;构建重组载体pc DNA3.1-p Survivin-TK并进行测序,通过BLAST对DNA序列的同源性进行比对;将该质粒载体转导入大肠杆菌DH5α中,通过菌液PCR扩增HSVtk基因,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。3.用重组质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK分别转染HL-7702、HEK293T、Hep G2及Hu H-7细胞,48小时后提取细胞总RNA及总蛋白,经RT-PCR法及Western blot法检测HSVtk基因在m RNA及蛋白水平的表达情况。4.重组质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK被转染到HL-7702、Hep G2及Hu H-7细胞中,48小时后,加入梯度剂量GCV处理,MTT法检测HSVtk/GCV自杀基因系统对细胞存活率的影响。5.质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK转染HL-7702、Hep G2及Hu H-7细胞后,加入150μg/ml GCV处理24小时,Hoechst 33258染色法检测细胞核形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内活性氧（ROS）水平;通过Caspase-3染色法在荧光显微镜下观察细胞内活化caspase-3水平。结果:1.通过PCR扩增得到survivin启动子序列,构建由survivin启动子介导的重组质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK,测序得DNA序列与Gen Bank中的HSVtk序列相同,重组质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK成功构建。2.RT-PCR法及Western blot法检测结果表明,HSVtk基因在Hep G2及Hu H-7细胞中表达明显,而在HL-7702、HEK293T细胞中均未见HSVtk基因的表达。3.MTT法检测得知,随着前体药物GCV剂量的升高,Hep G2及Hu H-7细胞存活率逐渐下降,与空白组相比,具有显着统计学差异（P﹤0.05）,而HL-7702细胞未见明显杀伤作用。4.通过Hoechst染色法分析,转染质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK的Hep G2及Hu H-7细胞在GCV处理后,其细胞核颜色发白呈致密浓染且染色质固缩,而HL-7702细胞的细胞核未见明显改变。5.流式细胞仪检测得知,经HSVtk/GCV自杀基因系统处理的Hep G2及Hu H-7细胞,其细胞凋亡率及细胞内活性氧水平显着升高,与空白组相比差异具有统计学意义（P﹤0.05）,而HL-7702细胞凋亡不明显,且活性氧水平也未见明显变化。6.Caspase-3染色法表明,Hep G2和Hu H-7细胞经HSVtk/GCV自杀基因系统干预后,荧光显微镜观察可见大量红色荧光,即caspase-3明显增多,而HL-7702细胞未见明显凋亡。结论:1.成功构建了一种新型的真核表达质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK。2.HSVtk自杀基因在Hep G2和Hu H-7细胞内成功表达,而在HL-7702、293T细胞内未见表达。3.HSVtk/GCV自杀基因系统对Hep G2和Hu H-7肝癌细胞有特异性的显着杀伤作用,而对HL-7702细胞未见显着杀伤。
刘霆[8]（2007）在《新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗结肠癌的实验研究》文中研究指明研究背景：结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，2000年世界癌症流行趋势分析表明，全球结、直肠癌发病率居恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位。近些年来我国大肠癌发病率的上升趋势亦十分明显。其中城市结肠癌的发病率以4％的年增长率递增，而男性结肠癌患者增加了58.8％。由于其临床表现常较隐匿且缺乏特异性，难以早期发现，大多数患者就诊时已属于中晚期，且结肠癌手术切除后转移或复发率高。化学治疗具有严重的毒副作用，如骨髓抑制，心、肝、肾等器官的损伤。手术切除是其重要的治疗手段，但中晚期患者术后转移或复发率高，化疗毒性反应大。因此需要寻求新的治疗方法。基因治疗是当前研究的热点，但面临载体安全性、靶向性差两大问题，临床使用受到限制。载体的问题是基因治疗的关键。许多的载体，病毒载体和非病毒载体以前已广泛应用，病毒载体主要包括腺病毒，逆转录病毒，腺相关病毒等；但病毒载体在安全性方面存在潜在的危险；免疫原性比较强，注射到机体后很快会被机体的免疫系统排斥，当静脉注射高浓度的腺病毒载体会使肝脏发生严重的炎症反应；非病毒载体目前常用的有脂质体及多聚阳离子聚合物；但脂质体和阳离子聚合物介导基因转移缺乏组织的特异性和靶向性，转染效率较低且易被网状内皮系统吞噬，基因表达时间短；因此研制新型的非病毒载体已成为研究的热点，纳米颗粒具有小尺寸效应，表面效应，随着颗粒直径变小，比表面积将会显着增大，故具有很高的化学活性，因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。研究表明，纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒，在短时间内，不会很快被吞噬细胞清除，从而更多的渗出到血管外，组织间隙，延长与细胞的接触时间，提高转染效率；通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解，但纳米基因载体有浓缩，保护DNA功能，与DNA形成一致密的结构，使DNA不被核酸酶消化降解。为了提高基因治疗载体的靶向性，降低对正常细胞的损伤，人们设计了很多方法，靶向性转录技术便是其中之一。靶向性转录技术是利用组织和细胞特异性启动子控制基因的转录，从而使治疗基因在特定的细胞中表达，达到靶向治疗的目的。癌胚抗原（CEA）是结肠癌等恶性肿瘤相对特异性标志物，在结肠癌中的阳性率约为70％-90％，在结肠癌肝转移及复发病例其阳性率更高，可作为结肠癌重要的监测指标，且癌胚抗原的肿瘤特异性也被许多肿瘤基因治疗所采用。CEA转录调控元件包括增强子元件和在5侧翼区域的启动子，这些元素能调控目的基因在癌胚抗原（CEA）为阳性的癌组织中表达，从而达到靶向治疗的目的。目的：本课题探讨由CEA启动子、CMV增强子组成的高活性嵌合启动子，通过融合启动子的调控提高融合自杀基因yCDglyTK在靶细胞表达的特异性；并以无毒副作用生物相容性好的磷酸钙纳米为载体，将该自杀基因靶向导入结肠癌细胞中，以达到提高基因治疗靶向性及安全性的目的。方法：本研究利用化学方法制备一种30nm大小、分散均匀的磷酸钙纳米颗粒，采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK表达载体，并以该纳米为载体将pcDNA3.1（-）CV·yCDglyTK质粒表达载体转染结肠癌lovo细胞系进行体外实验研究，荧光显微镜、流式细胞仪检测纳米的转染效率，分别用RT-PCR、Western-blot杂交等方法检测鉴定yCDglyTK融合自杀基因在lovo细胞内的表达；MTT法检测5-FC、GCV对野生型lovo细胞的毒性；MTT法、克隆形成实验检测自杀基因前药系统对表达自杀基因的lovo细胞的杀伤效应；绘制细胞生长曲线反映该系统对lovo细胞生长的影响；免疫组化及免疫荧光检测治疗前后自杀基因蛋白表达水平的变化；用高效液相色谱（HPLC）法测定处理前后前体药物5-FC向5-FU转化效率的变化；用pcDNA3.1（-）CV·yCDglyTK阳性克隆细胞移植Balb／C裸鼠进行肿瘤治疗的体内试验。结果：在经不同浓度的氯化钙等试剂修饰后，磷酸钙纳米颗粒能与质粒DNA有效结合，通过复合体吸附在细胞膜上并进入细胞内，增加进入细胞内DNA量，提高基因转染的效率，并且质粒DNA与纳米颗粒形成的复合体能有效的抵抗血清中酶类对DNA分子的降解，有效的保护DNA分子的完整性；用绿色荧光蛋白（GFP）基因作报告基因，与磷酸钙纳米颗粒结合后转染常规培养的lovo细胞，用荧光显微镜及流式细胞仪检测，发现该纳米具有较高的转染效率；5-FC和GCV在高浓度（5-FC＞200ug／ml，GCV＞50 ug／ml）时，对野生型Lovo细胞亦有一定的杀伤作用；对于yCDglyTK阳性lovo细胞，当5-FC的浓度为10ug／ml和200ug／ml时，细胞存活率分别是63.23％和11.02％；同时，结果显示，yCDglyTK阳性lovo细胞在两种前体药物5-FC和GCV同时存在的条件下，并没有大多数文献报告的显示出协同杀瘤作用，其作用反而低于单独使用5-FC；200ug／ml5-FC处理yCDglyTK阳性lovo细胞24小时后，用高效液相色谱法测定细胞上清中5-FU浓度是168ug／ml，5-FC向5-FU转化效率是84％；旁杀效应实验显示，在200 ug／ml 5-FC存在时，只要pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK质粒有20％的转染效率，细胞的相对存活率将下降为32.6％，说明该融合自杀基因前药系统具有有强大的“旁杀效应”；动物试验中，CVyCDglyTK+5-FC组的肿瘤与CPNP-CVyCD-glyTK+5-FC组、CPNP-CMVyCDglyTK+5-FC组有显着性差异（P＜0.05），与yCDglyTK+PBS及Lovo+5-FC组有极显着性差异（P＜0.01）。这说明纳米介导的自杀基因前药治疗均有明显的抑瘤作用。结论：1)磷酸钙纳米粒能有效介导pcDNA3.1（-）CV·yCDglyTK自杀基因质粒载体转染lovo细胞，且未显示明显毒副作用，因此该纳米可能成为一种新型的用于基因治疗的非病毒载体。2)5-FC与GCV对yCDglyTK阳性细胞均有明显杀伤作用，但二者无协同作用，其作用弱于单独5-FC而强于GCV。3)该融合自杀基因前药系统具有有强大的“旁杀效应”4)该融合自杀基因前药系统，当前体药物浓度5-FC<200 ug／ml，GCV<50ug／ml，在此浓度下，对不含自杀基因的lovo细胞毒性很低。5)体外与体内实验结果均显示，以磷酸钙纳米为载体介导CEA调控下的自杀基因在肿瘤的治疗中显示良好的靶向杀伤效应。
姚航[9]（2007）在《KDR启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸治疗乳腺癌的实验研究》文中指出研究背景乳腺癌是威胁女性健康的主要疾病之一,且其发病率在世界范围内有上升趋势。传统的手术、放疗、化疗和内分泌治疗方法有其自身的局限性,因此寻找新的疗法迫在眉睫。随着肿瘤生物学及分子生物学等新兴学科的发展,肿瘤的基因治疗成为一种新的治疗模式,其中自杀基因疗法是较为有效和颇具临床应用潜力的治疗策略。自杀基因疗法是利用基因工程技术将一些病毒或细菌等原核生物含有,而哺乳动物细胞中不含有或表达水平极低的前药转换酶基因导入肿瘤细胞进行表达,其产物可使无毒性的前药变成细胞毒物质,从而达到杀伤肿瘤细胞的作用。基因治疗要求目的基因能在肿瘤细胞特异性表达而不在正常细胞中表达,一个能达到这一目的的方法是应用靶向技术向肿瘤区域精确目的基因。有研究利用肿瘤细胞特异性基因调控元件调控自杀基因表达,如以erbB-2启动子驱动乳腺癌的自杀基因治疗,AFP基因启动子用于原发性肝癌自杀基因疗法等。但上述策略只能针对某一特殊类型肿瘤,且仅靶向肿瘤细胞。随着人们对肿瘤新生血管在肿瘤生长及转移中的重要作用的认识,许多学者将治疗靶点转移到肿瘤血管上,通过抑制肿瘤新生血管生成,切断肿瘤供养来抑制肿瘤生长,减少肿瘤的浸润和转移。研究表明:肿瘤血管的生长速度是正常组织的50-100倍,肿瘤血管之所以能持续生长关键在于其血管内皮细胞的增殖能力,在肿瘤血管内皮细胞的增殖中,血管内皮生长因子（vascularendothelial cell growth factor,VEGF）是最重要的因子,VEGF促进肿瘤血管的生长必须与血管内皮细胞表面的VEGF第二受体（kinase-domain insert containingreceptor,KDR）相结合方能促使血管内皮细胞分裂、增殖。KDR高表达于增生活跃的肿瘤血管内皮细胞及多数肿瘤细胞,而在正常组织不表达或表达甚微,因此,以KDR启动子序列驱动自杀基因,可使自杀基因在肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性表达,从而达到双重靶向治疗作用。这样,放大治疗作用的同时,又适应于多种肿瘤治疗。利用KDR启动子驱动的双自杀基因特异性杀伤肿瘤和抑制其血液供应,国内外已有报道并取得良好疗效。现代分子生物学研究表明,肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段、多基因参与的复杂疾病,而且在癌组织内可存在多种克隆的肿瘤细胞,不同类型的瘤细胞对不同基因治疗体系的敏感性有差异,所以单基因治疗常常不能取得良好的疗效。因此,联合基因治疗已成为目前肿瘤基因治疗的发展方向。联合基因治疗是指同时采用两种或两种以上的基因治疗策略来治疗肿瘤,利用各个基因治疗的优点,提高治疗效果,降低对机体正常组织的副作用。目前认为肿瘤不仅是细胞增殖分化异常性疾病,也是凋亡异常性疾病。凋亡调控失调可以异常地延长细胞的生存时间,促进有转化作用的基因突变的积累,并协助细胞抵抗免疫系统的监视作用,从而导致肿瘤的发生。随着对细胞凋亡调控异常在肿瘤发病学中的重要性的认识,在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因己构成肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白,survivin在凋亡调节中起着重要作用。survivin在人胚胎组织中高度表达并参与胚胎发育过程中的组织分化和器官形成,而在终末分化的成人组织中检测不到,却又广泛表达于多种肿瘤组织。同时Survivin在非增殖性的毛细血管内皮中的表达量极低,而体内增殖性血管内皮中survivin的表达量很高。因此,Survivin可作为另一个肿瘤血管及肿瘤细胞双重治疗的理想靶点。目前,利用survivin反义寡核苷酸特异性诱导肿瘤细胞和其供血血管内皮细胞凋亡的研究已成为肿瘤治疗研究方面的热点。尽管自杀基因和survivin反义寡核苷酸肿瘤治疗上均取得一定的疗效,但肿瘤的复杂性和多样性决定了单一基因治疗常常不能取得良好的疗效。基于上述研究,为弥补单基因治疗的不足,发挥联合基因靶向治疗的优势,本课题拟联合应用腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统和survivin反义寡核苷酸,并观察两者单独及联合应用对乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮ECV304细胞的体外靶向杀伤作用及其体内抑瘤效应,为进一步开展联合基因治疗乳腺癌的研究提供实验依据。注:本课题来源于:广东省科技计划项目基金（2005831201009）。目的研究KDR启动子驱动的双自杀基因在乳腺癌细胞MCF-7、血管内皮细胞ECV304内的转染及表达,给予前药后体外杀伤细胞的作用。观察survivin反义寡核苷酸对MCF-7和ECV304细胞中survivin基因表达的封闭作用和细胞的生长抑制作用。研究联合应用KDR启动子驱动的双自杀基因和survivin反义寡核苷酸作用MCF-7、ECV304细胞,观察两种基因在细胞内的表达及对细胞的增殖抑制作用。最后,以MCF-7细胞株建立裸鼠皮下移植瘤动物模型,观察联合基因治疗体系的体内抗肿瘤和抑制血管再生作用。方法一、重组腺病毒的包装、扩增、纯化及其滴度测定和鉴定携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdEsayKDRP-CDglyTK在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,通过荧光显微镜下293细胞中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达观察重组病毒的包装与复制,并以PCR方法鉴定重组腺病毒。二、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用用重组腺病毒AdKDR-CDglyTK感染MCF-7细胞、ECV304细胞及LS174T细胞（对照）,观察腺病毒的感染效率,RT-PCR方法检测目的基因的表达。在前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）作用下,测定肿瘤细胞和血管内皮细胞的存活率,观察旁观者效应。三、survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对MCF-7、ECV304细胞的生长抑制效应。针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸,采用脂质体介导转染MCF-7、ECV304细胞,采用western blot、RT-PCR方法检测survivin反义寡核苷酸对MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白及mRNA表达的作用。测定转染前后细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。四、KDR启动子驱动双自杀基因和survivin反义寡核苷酸联合应用对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用将重组腺病毒AdKDR-CDglyTK体外感染表达KDR的MCF-7、ECV304细胞株,同时用survivinASODN转染同一细胞株,观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况,应用RT-PCR方法检测CDglyTK mRNA的表达,western blot方法检测基因转染对细胞survivin蛋白表达的影响。给予前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）后,MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应,透射电镜观察细胞超微结构变化。五、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统联合survivin反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应采用BALB/C雌性裸鼠,4～6周龄,对数生长期的MCF-7细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下,建立乳腺癌动物模型,当肿瘤达0.5cm直径时,将荷瘤裸鼠随机分为4组,A组:阴性对照组(瘤体及瘤周注射LipolifectmainTM2000与前药5-FC、GCV);B组:survivinASODN治疗组（瘤体及瘤周注射survivin反义寡核苷酸）;C组:AdKDR-CDglyTK腺病毒治疗组（瘤体及瘤周注射重组腺病毒与前药5-FC和GCV）;D组:survivinASODN+AdKDR-CDglyTK腺病毒治疗组（瘤体及瘤周注射重组腺病毒与前药5-FC、GCV+survivin反义寡核苷酸）。治疗前后测量肿瘤体积,治疗结束后测肿瘤重量,计算肿瘤抑瘤率,观察该治疗体系的体内抑瘤效应。治疗结束后行组织内CDglyTK基因和survivin基因表达的检测、肿瘤组织透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构变化及微血管密度（microvesseldensity,MVD）检查。结果一、重组腺病毒的包装、扩增、滴度测定及鉴定pAdEsay-KDR-CDglyTK经PacⅠ酶切线性化后,以LipolifectmainTM2000介导转染293细胞,24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达,3～5d表达达到高峰,7～10d多数细胞变圆并出现噬菌斑后收集细胞,反复冻融4次。收集上清液再次感染293细胞以大量扩增病毒。所得病毒纯化后滴度达2×1012pfu/ml。PCR鉴定:扩增出2.4kb的CDglyTK基因片断和580bp的KDR启动子片断。二、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.重组腺病毒对细胞的感染效率采用不同感染复数（multiple of infection,MOI）的重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK分别感染MCF-7、ECV304及LS174T细胞,72h后观察发现:细胞的感染率随腺病毒滴度的增加而递增,当MOI=10时,仅少数细胞有荧光;当MOI=100时,80%以上的GFP表达;MOI=200时,95%以上细胞被感染,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率。2.重组腺病毒感染细胞CDglyTK基因表达通过RT-PCR检测发现,除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,余各组均检测到目的基因的表达。3.重组腺病毒对各细胞的体外抑制效应以MOI=100的重组腺病毒AdKDR-CDglyTK感染各细胞株,加入不同浓度的前药后MTT法检测细胞生长抑制率。结果:感染腺病毒AdKDR-CDglyTK的MCF-7及ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,转基因细胞的存活率随前药浓度的增加而递减,呈浓度-效应关系。而感染腺病毒AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感,转基因细胞的存活率不随前药浓度的改变而变化,细胞存活率差异无统计学意义（P=0.816）。;当GCV浓度高于40μg/ml,5-FC浓度高于250μg/ml时,在相同前药浓度下,MCF-7、ECV304细胞存活率低于LS174T细胞,差异有统计学意义（P＜0.001）。4.旁观者效应将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系对MCF-7和ECV304细胞存在旁观者效应,对LS174T细胞无旁观者效应。在转基因细胞所占比例相同的情况下,MCF-7和ECV304细胞存活率低于LS174T细胞存活率,差异有统计学意义（P＜0.001）。三、survivin反义寡核苷酸对MCF-7、ECV304细胞的生长抑制效应1.MTT法检测各组MCF-7、ECV304细胞生长抑制率空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间相比,细胞生长抑制率差异无统计学意义（P＞0.05）。Survivin反义寡核苷酸作用的三组分别与空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组相比,细胞生长抑制率显着升高（P＜0.001）。经不同浓度的survivinASODN处理的细胞均受到抑制,随着survivinASODN浓度的增加,抑制作用越来越明显,呈浓度-效应关系,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。2.MCF-7、ECV304细胞survivin mRNA的表达对照组和survivinASODN处理组均在191bp处出现特异性的survivin条带。空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间比较,survivin mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN转染后,survivin mRNA表达与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。随着ASODN浓度的增加,survivin mRNA的表达呈逐渐降低的趋势,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。3.MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白的表达Survivin蛋白在MCF-7、ECV304细胞中有高度表达。空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN转染后survivin蛋白与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。随着ASODN浓度的增加,survivin蛋白的表达呈逐渐降低的趋势,不同浓度ASODN组之问相比差异有统计学意义（P＜0.05）。4.Survivin ASOON对MCF-7、ECV304细胞凋亡率的影响经200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN处理MCF-7、ECV304细胞48h后,与空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组相比,survivinASODN组在G1期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着ASODN浓度的增加,细胞凋亡率呈逐渐上升的趋势,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。四、KDR启动子驱动双自杀基因和survivin反义寡核苷酸联合应用对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.SurvivinASODN对MCF-7、ECV304细胞的转染和重组腺病毒的感染效率转染400ng/ml survivin ASODN后,56%MCF-7细胞和51%ECV304细胞的胞核、胞浆见到棕色荧光。MOI=100的重组腺病毒感染细胞后,84%MCF-7细胞和78%ECV304细胞GFP表达阳性。SurvivinASODN和重组腺病毒联合作用后,52%MCF-7细胞和49%ECV304细胞内见到棕色荧光,与survivinASODN组比较无显着性差异（P＞0.05）;同时86%MCF-7细胞和72%ECV304细胞内有绿色荧光出现,与AdKDR-CDglyTK组比较无显着性差异（P＞0.05）。2.转基因MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白表达Survivin蛋白在MCF-7、ECV304细胞中有高度表达。阴性对照组、AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;但与survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。3.转基因细胞CDglyTK基因表达通过RT-PCR检测MCF-7和ECV304细胞,发现阴性对照组、survivinASODN组细胞中无CDglyTKmRNA表达,其余两组细胞中均有CDglyTKmRNA表达。4.基因转染对MCF-7、ECV304细胞的体外抑制效应阴性对照组细胞均对前药不敏感,当GCV、5-FC浓度分别高于40μg/ml、250μg/ml时,在相同GCV、5-FC浓度条件下,阴性对照组MCF-7、ECV304细胞存活率与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。survivinASODN与AdKDR-CDglyTK基因联用后,随着前药浓度的增加,细胞存活率迅速下降,有显着性差异（P＜0.001）。当GCV、5-FC浓度分别高于40μg/ml、250μg/ml时,在相同GCV、5-FC浓度条件下,survivinASODN与AdKDR-CDglyTK基因联合作用组细胞存活率低于survivinASODN组或AdKDR-CDglyTK组,差异有统计学意义（P＜0.001）。但在GCV100μg/ml、5-FC2000μg/ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK,两者间无显着差异（P＞0.05）。SurvivinASODN与AdKDR-CDglyTK两者联合使用的相互作用指数CDI值＜1,在GCV60μg/ml、5-FC500μg/ml时,CDI值＜0.7,但在GCV100μg/ml、5-FC2000μg/ml时,CDI值＞1。5.旁观者效应阴性对照组无旁观者效应,在相同比例混合细胞和相同前药浓度下,survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组细胞存活率均低于AdKDR-CDglyTK组和survivinASODN组（P＜0.05）,提示联合基因治疗组较单一基因治疗具有更强的旁观者效应。6.联合基因治疗后MCF-7及ECV304细胞的电镜观察电镜下观察:可见部分细胞体收缩、染色质边聚,有些胞核形态不规则,核发生碎裂,胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片（凋亡小体）,有些整个凋亡细胞被吞噬和降解。五、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统联合survivin反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应1.基因治疗对裸鼠移植瘤的抑制作用开始治疗前,阴性对照组、survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组、SurvivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤平均体积无显着性差异（P＞0.05）。治疗结束时,阴性对照组肿瘤体积较治疗前显着增大（P＜0.001）,其他3组治疗组肿瘤体积均低于治疗前,有显着性差异（P＜0.05）。3组治疗组肿瘤体积均低于阴性照组肿瘤体积,有显着性差异（P＜0.001）。联合基因治疗组肿瘤体积与单一基因组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗结束后处死裸鼠,剥离肿瘤测重量,survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组、SurvivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤重量较阴性对照组有不同程度的降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）。联合基因治疗组肿瘤重量与单一基因组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。抑瘤率测定可见联合基因治疗组明显高于survivinASODN组和AdKDR-CDglyTK组,差异在统计学上均有显着性意义（P＜0.05）。2.裸鼠移植瘤MVDCD34抗体染色大部分毛细微血管和单个内皮细胞。SurvivinASODN、AdKDR-CDglyTK组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组移植瘤MVD显着低于阴性对照组MVD（P＜0.05）,survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤MVD最少,与survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组比较均有显着性差异（P＜0.05）。3.裸鼠移植瘤细胞survivin蛋白表达Survivin蛋白在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达。阴性对照组、AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;但与survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。4.裸鼠移植瘤细胞CDglyTK mRNA表达通过RT-PCR检测裸鼠移植瘤细胞,发现阴性对照组、survivinASODN组细胞中无CDglyTKmRNA表达,其余两组细胞中均有CDglyTKmRNA表达。5.裸鼠移植瘤细胞的电镜观察联合基因治疗组细胞皱缩,细胞膜微绒毛消失。细胞核膜亦发生皱缩或消失,染色质浓缩,沿核膜下排列成不同形状和大小的块状,或发生断裂,致密的凋亡小体亦较多见。结论1.本实验构建了KDR驱动CD/TK自杀基因系统的重组腺病毒,重组腺病毒对MCF-7细胞、ECV304细胞及LS174T细胞均具有较高的转染率,且对三者转染率相似;2.重组腺病毒能将KDR驱动的CD/TK融合基因转入MCF-7细胞及ECV304细胞中并进行有效表达,对MCF-7细胞及ECV304细胞具有靶向杀伤作用,这种杀伤作用具有浓度依赖性;3.该治疗体系的作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应;4.脂质体介导转染针对survivin mRNA的反义寡核苷酸可在mRNA及蛋白两个水平上有效地降低MCF-7,ECV304细胞内survivin的表达;5.经不同浓度的survivinASODN处理的MCF-7,ECV304细胞的增殖均受到抑制,随着survivin ASODN浓度的增加,抑制作用越来越明显,呈浓度-效应关系;survivinASODN的作用机制为诱导靶细胞的凋亡;6.KDR启动子驱动的双自杀基因重组腺病毒与survivinASODN可同时作用于MCF-7、ECV304细胞,而相互并不影响各自携带的基因在细胞内的转染;7.KDR启动子驱动的双自杀基因重组腺病毒和survivinASODN相互不影响各自携带的基因在MCF-7、ECV304细胞内的表达;8.在前药浓度较低时,AdKDR-CDglyTK和survivinASODN联合基因作用较单一基因对MCF-7,ECV304细胞具有更强的杀伤作用,并且两基因存在协同作用;9.AdKDR-CDglyTK和survivinASODN联合治疗组较单一基因表现出更强的旁观者效应;10.腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统和survivinASODN对乳腺癌裸鼠移植瘤及其MVD均具有明显的抑制作用,联合基因较单一基因具有更强的抗肿瘤和抑制MVD作用;11.Survivin蛋白在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达,SurvivinASODN可下调survivin蛋白表达。重组腺病毒能将KDR驱动的CD/TK融合基因导入乳腺癌裸鼠移植瘤细胞中并进行有效表达;12.携带双自杀基因的重组腺病毒与survivinASODN可同时作用于乳腺癌裸鼠移植瘤细胞,而相互并不影响各自携带的基因在肿瘤细胞内的表达。
李瑞[10]（2007）在《VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸治疗大肠癌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的本研究拟运用已构建好的携有血管内皮细胞生长因子启动子（VEGFP）并含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因和Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的重组腺病毒（Ad）载体，同时配制脂质体与survivin反义寡核苷酸转染复合物，在体外和体内分别感染大肠癌Lovo细胞，以研究Ad-VEGFP-CDglyTK基因治疗系统及survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤作用和体内抑瘤作用。一方面通过survivin反义寡核苷酸抑制survivin表达，诱导分泌大肠癌细胞凋亡，并消除血管内皮生长因子（VEGF）在血管形成中的细胞保护作用，导致内皮细胞凋亡和毛细血管迅速退化；另一方面通过VEGF启动子介导双自杀基因选择杀伤分泌VEGF的大肠癌细胞，减少VEGF的分泌，通过两者的协同作用抑制肿瘤的生长。方法一、Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究运用脂质体将不同浓度的Survivin ASODN转染Lovo细胞，用MTT法测定细胞存活率，采用RT-PCR方法测定survivin mRNA的表达状况，Western blot方法检测大肠癌Lovo细胞survivin蛋白的表达，并用流式细胞仪检测survivinASODN对大肠癌Lovo细胞周期的影响。二、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究复苏和扩增含有荧光蛋白（GFP）报告基因重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK，再用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒，并进行重组腺病毒的滴度测定，然后感染大肠癌Lovo细胞，给予前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）进行作用一定的时间，测定重组腺病毒对大肠癌Lovo细胞转染效率、细胞存活率及旁观者效应，并进行细胞形态学观察，然后重组腺病毒与survivin ASODN的联合作用观察大肠癌Lovo细胞的增殖及凋亡。三、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究将Lovo细胞接种于4周龄BALB／C裸鼠皮下建立裸鼠大肠癌移植瘤动物模型，当肿瘤达0.5cm直径时，将荷瘤裸鼠随机分组，并分别注射相应的survivin反义寡核苷酸及重组腺病毒，再向动物模型腹腔内注射5-FC和GCV，测量实体瘤重量变化、计算抑瘤率，治疗结束后取肿瘤组织进行HE染色观察病理学变化，免疫组化法检测微血管密度。结果一、Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究1．细胞成活率的测定不同浓度的Survivin反义寡核苷酸，Survivin正义寡核苷酸和空白对照转染大肠癌Lovo细胞后得到的细胞成活率，结果经单因素方差分析，Survivin ASODN组与Survivin SODN组、空白对照组比较，差异显着（P＜0.05），有统计学意义，说明Survivin ASODN与其他两组相比对大肠癌细胞有明显的抑制作用，而另两组间无统计学差异（P＞0.05）。Survivin ASODN在400ng／ml浓度时，对大肠癌细胞的抑制作用最明显。2．RT-PCR检测Survivin ASODN对Lovo细胞mRNA表达的影响RT-PCR产物电泳显示，对照组和处理组均出现特异性的Survivin条带，Survivin ASODN各组Survivin mRNA的表达明显低于空白对照组、脂质体组和Survivin SODN组等三组，经凝胶图像分析仪分析结果显示：空白对照组、脂质体组和SODN组之间无显着性差异（P＞0.05），ASODN各组和上述三组的Survivin／GADPH，差异具有显着性（P＜0.05），其中以400ng／ml ASODN组及800ng／ml ASODN组与上述三组差异最为显着。3．Western blot方法检测大肠癌Lovo细胞survivin蛋白的表达western blot检测表明：空白对照组、脂质体组和SODN组之间，Survivin蛋白表达无明显性差异（P＞0.05），200ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达略有降低，400ng／ml ASODN组及800ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达较空白对照组、脂质体组和SODN组明显降低，有统计学意义（P＜0.05），其中400ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达为16.33±1.48。4．流式细胞仪检测survivin ASODN对大肠癌Lovo细胞周期的影响流式细胞仪检测发现：实验各组凋亡峰分别为：（0.91±0.29）％、（0.87±0.22）％、（18.56±2.80）％和（30.47±1.73）％，ASODN组与空白对照组、SODN组有显着差异（P＜0.05），提示survivin ASODN能够大量诱导细胞凋亡。G1期细胞分别为：（75.22±2.13）％、（72.17±2.63）％、（43.24±2.75）％和（9.37±2.67）％，各转染组G1期细胞显着减少。各组S期细胞无明显变化，无统计学意义。G2／M期细胞分别为：（4.46±1.44）％、（5.43±1.43）％、（13.40±2.04）％和（39.85±2.66）％，ASODN组较空白对照组、SODN组G2／M期细胞显着增加（P＜0.05），出现G2／M期阻滞现象，并且survivin ASODN能够以剂量依赖的方式诱导大肠癌Lovo细胞发生G2／M期阻滞。二、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究1．重组腺病毒体外转染Lovo细胞的转染效率观察发现：Lovo细胞转染重组腺病毒后在荧光显微镜下呈现绿色荧光，未转染的细胞则无着色现象。采用不同MOI的重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK分别转染Lovo，发现重组腺病毒对Lovo细胞的转染效率随腺病毒滴度的增加而递增，当MOI=100时，90％以上的GFP表达，说明本实验室构建的重组腺病毒体外转染效率高，目的基因能有效地得以表达。2．MTT法检测重组腺病毒对大肠癌Lovo细胞存活率MTT法检测细胞成活率结果提示：用不同浓度的5-FC、GCV或者5-FC+GCV治疗后，重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK转染后肿瘤细胞的存活率随药物浓度增加均呈逐渐下降趋势，即对前药的作用呈浓度依赖性。单用浓度1μg／ml的GCV时，细胞存活率为（56.47±2.39）％，单用浓度为40μg／ml的5-FC，细胞存活率为（53.35±2.20）％，二者联合时，细胞存活率分别为（27.23±1.46）％，提示在5-FC和GCV浓度固定的情况下，单一前药和双前药作用下的细胞存活率相比，有显着性差异（P＜0.05）。3．旁观者效应旁观者效应结果如下：重组腺病毒按不同比例转染Lovo细胞，在20％的混合比例，GCV组细胞存活率为（65.25±1.58）％，5-FC组细胞存活率为（63.63±1.71）％，GCV+5-FC组细胞存活率为（45.60±2.07）％，它们均显着低于对照组（P＜0.05），GCV组与5-FC组无明显差异。我们观察到随着转染病毒Lovo细胞所占比例的增加，细胞存活率逐渐降低，转染病毒组与对照组均有显着差异（P＜0.05），GCV+5-FC组较GCV组与5-FC组亦有显着差异（P＜0.05），提示CD与TK自杀基因具有旁观者效应，VEGF启动子驱动的双自杀基因旁观者效应更强，并呈现协同效应。4．药物作用后电镜的观察电镜下观察：可见部分细胞体收缩、染色质边聚，有的胞核形态不规则，核发生碎裂，胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片，有的可见凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象，同时见部分细胞呈坏死表现。5．VEGF启动子驱动的双自杀基因与Survivin ASODN联合作用对Lovo细胞增殖的影响各实验组作用24h后，细胞存活率分别为：空白对照组（98.35±1.22）％、Survivin ASODN组（62.49±2.47）％、Ad-VEGFP-CDglyTK组（69.43±1.49）％、ASODN+Ad-VEGFP-CDglyTK组（31.48±2.38）％，空白对照组与其他三组均有显着性差异（P＜0.05），基因联合治疗组细胞存活率较Survivin ASODN组及Ad-VEGFP-CDglyTK组亦明显降低，有统计学意义（P＜0.05），提示Survivin ASODN与VEGF启动子驱动的双自杀基因对于大肠癌Lovo细胞的抑制，具有有协同作用。6．重组腺病毒与survivin ASODN的联合作用对细胞凋亡的影响流式细胞仪检测显示：单独应用Survivin ASODN的Lovo细胞的凋亡率为（19.55±2.38）％，单独应用Ad-VEGFP-CDglyTK的Lovo细胞的凋亡率为（21.83±2.23）％，两者联合应用的Lovo细胞的凋亡率为（38.53±2.30）％，三者均能促进Lovo细胞的凋亡作用，与空白对照组有显着差异（P＜0.05）。Survivin ASODN及Ad-VEGFP-CDglyTK处理组相比没有明显差异（P＞0.05）。Survivin ASODN与Ad-VEGFP-CDglyTK二者联合应用较Survivin ASODN及Ad-VEGFP-CDglyTK处理组差异显着（P＜0.05），有统计学意义，提示Survivin ASODN和Ad-VEGFP-CDglyTK两者对于大肠癌Lovo细胞的凋亡具有协同作用。三、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究1．荷瘤裸鼠肿瘤生长及基因联合抑瘤作用Lovo细胞接种裸鼠皮下4-5天后，陆续可在皮下摸到粟粒样大小肿瘤结节，至接种后第12天，所有被接种裸小鼠均出现结节，移植成功率为100％。裸鼠成瘤达0.5cm后开始分组治疗，四组初始瘤体体积方差分析无显着差异（P=0.389）。治疗结束时最终瘤重及抑瘤率分别为：空白对照组（516.58±10.58）mg；重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组（238.74±15.77）mg，（53.78±3.12）％；Survivin ASODN组（225.61±13.47）mg，（56.23±2.60）％；基因联合治疗组（63.70±3.41）mg，（87.66±0.70）％。空白对照组与其他三组差异显着（P＜0.05），基因联合治疗组与另外两组比较亦差异显着（P＜0.05），提示Survivin ASODN及VEGF驱动的双自杀基因均具有抑瘤作用，但二者联合治疗抑瘤作用更为明显，具有协同作用。2．移植瘤瘤体病理变化常规病理下见肿瘤细胞生长受抑制，特别是基因联合治疗组抑瘤作用最明显，肿瘤组织切片中可见片状坏死区，而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。3．微血管密度的检测检测肿瘤组织MVD发现：空白对照组MVD为19.25±3.19、重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组MVD为11.33±2.46、Survivin ASODN组MVD为10.42±2.35、基因联合治疗组MVD为3.33±1.56，空白对照组MVD明显高于其他三组（P＜0.05），重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组及Survivin ASODN组MVD均高于基因联合治疗组，并有显着差异（P＜0.05）。结论1．Survivin ASODN转染大肠癌Lovo细胞，阻碍了survivin mRNA转录及翻译的过程，survivin蛋白表达下降。2．Survivin ASODN可以抑制大肠癌Lovo细胞的增殖，且随浓度增加，其对细胞的抑制作用更明显。3．Survivin ASODN封闭survivin基因的表达，可诱导结肠癌Lovo细胞的凋亡。4．VEGF启动子驱动的双自杀基因对大肠癌Lovo细胞具有明显的体外杀伤作用，其杀伤作用强于单自杀基因。5．VEGF启动子驱动的双自杀基因作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应，表现为处理后抑制靶细胞的增殖及诱导靶细胞的凋亡。6．VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin反义寡核苷酸联合应用在体外实验中，对抑制大肠癌Lovo细胞的增殖和诱导细胞凋亡过程起协同作用。7．VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin反义寡核苷酸均具有一定的体内抑瘤作用，而且二者联合应用，对于肿瘤的抑制作用更加显着，具有协同作用。
二、逆转录病毒介导HSVtk基因转导体外抗结肠癌的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、逆转录病毒介导HSVtk基因转导体外抗结肠癌的作用（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）复方苦参注液射增效顺铂抗p53突变型结肠癌作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 概述 |
| 1.1 立题背景和意义 |
| 1.2 本课题的研究内容、技术路线图及创新点 |
| 1.2.1 研究思路 |
| 1.2.2 技术路线图 |
| 1.2.3 主要创新点 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 结肠癌及其治疗 |
| 2.2 P53突变与结肠癌 |
| 2.2.1 P53突变与结肠癌的发生发展 |
| 2.2.2 P53突变与结肠癌化疗耐药 |
| 2.2.3 P53突变型结肠癌的治疗策略 |
| 2.3 复方苦参注射液与肿瘤治疗 |
| 2.3.1 复方苦参注射液概述 |
| 2.3.2 CKI在肿瘤化疗增敏中的应用 |
| 2.4 TRAIL信号通路 |
| 2.4.1 TRAIL信号通路概述 |
| 2.4.2 TRAIL信号通路与结肠癌的治疗 |
| 第三章 CKI选择性增效顺铂抗p53 突变型结肠癌 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞学操作方法 |
| 3.3.2 分子生物学操作方法 |
| 3.3.3 磺酰罗丹明B染色法 |
| 3.3.4 克隆形成实验 |
| 3.3.5 P53突变型HCT116 细胞的构建 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Cis、5FU和CKI的体外抗结肠癌活性 |
| 3.4.2 CKI对顺铂和5氟尿嘧啶体外抗结肠癌活性的影响 |
| 3.4.3 CKI选择性增效顺铂抗SW480结肠癌细胞生长 |
| 3.4.4 P53突变型HCT116细胞的构建 |
| 3.4.5 CKI选择性增效顺铂抗p53突变型HCT116细胞生长 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 CKI增效顺铂抗p53突变型结肠癌的作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 转录组学实验方法 |
| 4.3.2 生物信息学分析差异表达基因 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 差异表达基因的mRNA鉴定 |
| 4.4.2 差异表达基因的聚类分析 |
| 4.4.3 差异表达基因的GO功能富集分析 |
| 4.4.4 差异表达基因的KEGG通路富集分析 |
| 4.4.5 Cytokine-Cytokine receptor interaction途径参与CKI增效Cis抗SW480 细胞生长 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 CKI通过TRAIL通路增效Cis抗 SW480 细胞生长 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 试剂配制方法 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 抑制剂共处理细胞 |
| 5.3.2 Western Blot |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 CKI增效顺铂调节TRAIL信号通路 |
| 5.4.2 CKI增效顺铂诱导细胞凋亡 |
| 5.5 小结与讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 研究工作总结 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 cGAS-STING信号在癌症免疫和免疫治疗中的作用 |
| 2.1 CGAS-STING信号通路抗肿瘤机制 |
| 2.1.1 细胞质DNA如何积聚? |
| 2.1.2 cGAS-STING通路消除癌细胞机制 |
| 2.2 CGAS-STING通路在治疗中的应用 |
| 2.2.1 单药治疗 |
| 2.2.2 STING激动剂联合疗法 |
| 2.3 STING免疫疗法:一把双刃剑 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞来源和细胞培养条件 |
| 3.3.2 细胞复苏 |
| 3.3.3 细胞换液 |
| 3.3.4 细胞传代 |
| 3.3.5 细胞冻存 |
| 3.3.6 细胞计数 |
| 3.3.7 Trizol法提取HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的RNA |
| 3.3.8 RNA逆转录 |
| 3.3.9 定量实时聚合酶链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 3.3.10 HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.11 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.12 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导 |
| 3.3.13 过表达慢病毒载体的构建及转染 |
| 3.3.14 Trizol法提取vector HeLa、shSTING-Hela、vectorSiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STING细胞的RNA |
| 3.3.15 RNA逆转录 |
| 3.3.16 定量实时聚合酶链式反应 |
| 3.3.17 vector HeLa、shSTING-Hela、vector SiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STNG细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.18 蛋白质免疫印迹实验 |
| 3.3.19 宫颈癌细胞增殖实验 |
| 3.3.20 宫颈癌细胞平板克隆实验 |
| 3.3.21 宫颈癌细胞划痕实验 |
| 3.3.22 宫颈癌细胞Transwell小室迁移实验 |
| 3.3.23 宫颈癌细胞侵袭实验 |
| 3.3.24 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 STING在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中的表达 |
| 3.4.2 稳定的沉默STING细胞系、STING过表达细胞系的鉴定 |
| 3.4.3 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞系细胞增殖和克隆形成的影响 |
| 3.4.4 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.5 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.2 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.3 核蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)和免疫印迹实验 |
| 4.3.5 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.6 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.7 CCK8实验 |
| 4.3.8 平板克隆 |
| 4.3.9 Transwell小室迁移 |
| 4.3.10 Transwell小室侵袭 |
| 4.3.11 统计学方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.4.2 过表达STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 4.4.3 STING调控宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路机制探讨 |
| 4.4.4 β-catenin通路抑制剂对沉默STING介导的宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的影响(rescue实验) |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 沉默STING促进宫颈癌细胞增殖的体内实验 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞的复苏、传代及培养 |
| 5.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 5.3.3 裸鼠体重测量 |
| 5.3.4 裸鼠移植瘤组织大小的测量 |
| 5.3.5 肿瘤组织脱水及包埋 |
| 5.3.6 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeingtechniques,HE) |
| 5.3.7 免疫组织化学染色技术(Immunohistochemistry,IHC) |
| 5.3.8 统计学方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 沉默STING的宫颈癌细胞移植瘤对裸鼠体重的影响 |
| 5.4.2 沉默STING对裸鼠移植瘤体积的影响 |
| 5.4.3 裸鼠肿瘤组织HE染色结果 |
| 5.4.4 裸鼠肿瘤组织STING免疫组化染色结果 |
| 5.4.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化Ki67染色结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）锌指蛋白70在结肠炎相关结直肠癌发生发展及铃兰毒苷抗结直肠癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 锌指蛋白70通过调控THP-1巨噬细胞中NLRP3炎性小体和STAT3激活并促进炎症相关结直肠癌发生发展 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要使用仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 过表达质粒和Si-RNA转染 |
| 2.3.3 ELISA技术(酶联免疫吸附测定) |
| 2.3.4 蛋白免疫印记实验 |
| 2.3.5 免疫荧光实验 |
| 2.3.6 RT-PCR实验 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.8 Duolink PLA技术 |
| 2.3.9 EdU实验 |
| 2.3.10 细胞集落形成实验 |
| 2.3.11 AAV9-GFP的构建和尾静脉注射 |
| 2.3.12 AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型 |
| 2.3.13 免疫组织化学实验 |
| 2.3.14 统计学分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 ZNF70在LPS/ATP诱导的THP-1细胞中上调Pro-IL-1β和成熟IL-1β的表达 |
| 2.4.2 ZNF70在LPS/ATP诱导的THP-1细胞中促进NLRP3炎性小体成分的表达 |
| 2.4.3 ZNF70通过NLRP3炎性小体促进LPS和ATP诱导的THP-1细胞IL-1β分泌 |
| 2.4.4 ZNF70在LPS/ATP诱导的THP-1细胞中促进NLRP3炎性小体复合物的装配 |
| 2.4.5 ZNF70与NLRP3相互作用 |
| 2.4.6 ZNF70促进NLRP3上连接的K48去泛素化 |
| 2.4.7 ZNF70在LPS和ATP诱导的THP-1细胞中通过激活STAT3促进pro-IL-1β的合成 |
| 2.4.8 ZNF70在L+A-MΦCM条件培养基培养的HCT116细胞中促进STAT3激活 |
| 2.4.9 ZNF70在L+A-MΦCM条件培养基培养的HCT116细胞中通过介导STAT3的激活促进细胞增殖 |
| 2.4.10 ZNF70敲低可改善AOM/DSS诱导的炎症相关结直肠癌模型 |
| 2.4.11 AAV介导的ZNF70敲低可抑制AOM/DSS小鼠NLRP3炎性小体和STAT3的激活 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 铃兰毒苷通过调控结直肠癌中JAK2/STAT3(T705)和mTOR/STAT3(S727)信号通路之间的串扰促进HCT116细胞凋亡并抑制增殖和血管生成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 荧光素酶报告基因实验 |
| 3.3.3 MTT实验 |
| 3.3.4 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.3.5 RT-PCR实验 |
| 3.3.6 免疫荧光实验 |
| 3.3.7 EdU实验 |
| 3.3.8 细胞凋亡实验 |
| 3.3.9 细胞周期实验 |
| 3.3.10 集落形成实验 |
| 3.3.11 小管形成实验 |
| 3.3.12 侵袭实验 |
| 3.3.13 划痕实验 |
| 3.3.14 分子对接实验 |
| 3.3.15 裸鼠异种移植瘤实验 |
| 3.3.16 免疫组织化学实验 |
| 3.3.17 Si-RNA转染 |
| 3.3.18 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 铃兰毒苷抑制结直肠癌细胞的存活率 |
| 3.4.2 铃兰毒苷抑制STAT3的激活 |
| 3.4.3 铃兰毒苷抑制JAK1,JAK2和Src的激活 |
| 3.4.4 铃兰毒苷抑制PI3K/AKT/mTOR/STAT3信号通路 |
| 3.4.5 铃兰毒苷通过干扰JAK2和mTOR之间的串扰抑制STAT3激活 |
| 3.4.6 铃兰毒苷抑制STAT3调控的下游靶基因的表达 |
| 3.4.7 铃兰毒苷抑制HCT116细胞增殖 |
| 3.4.8 铃兰毒苷促进HCT116细胞凋亡 |
| 3.4.9 铃兰毒苷抑制内皮细胞的血管生成 |
| 3.4.10 铃兰毒苷抑制人结肠癌细胞HCT116裸鼠异种移植瘤的生长 |
| 3.4.11 铃兰毒苷抑制人结肠癌细胞HCT116裸鼠异种移植瘤组织中STAT3及STAT3相关基因的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (在读期间发表论文目录) |
（5）低浓度地西他滨促HT29结肠癌细胞增殖和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 低浓度地西他滨促HT29 结肠癌细胞系的增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 动态转录组学探究地西他滨促HT29 增殖机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 低浓度地西他滨激活Cyclin E1 介导的G1/S转化和激活Bcl-2 抑制内源性凋亡 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 低浓度地西他滨通过去甲基化上调HT29 结肠癌细胞Bcl-2 的表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 地西他滨治疗结直肠癌研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主持的科研项目和发表的专着与论文 |
| 致谢 |
（6）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 质粒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验所需引物 |
| 1.6 主要仪器及器材 |
| 1.7 主要试剂的配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组质粒pcDNA3.1-pSurvivin-TK的构建与鉴定 |
| 2.2 细胞培养与转染 |
| 2.3 RT-PCR法 |
| 2.4 Western blot法 |
| 2.5 MTT法 |
| 2.6 Hoechst染色法 |
| 2.7 Annexin V-PI细胞凋亡检测法 |
| 2.8 细胞内活性氧的荧光探针检测法 |
| 2.9 Caspase-3 染色法 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 pcDNA3.1-pSurvivin-TK质粒的构建与鉴定 |
| 3.3 RT-PCR法检测HSVtk基因的mRNA表达 |
| 3.4 Western blot法检测HSVtk基因的蛋白表达 |
| 3.5 MTT法检测细胞存活率 |
| 3.6 Hoechst染色法检测细胞凋亡 |
| 3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化 |
| 3.8 HSVtk/GCV系统对细胞内活性氧水平的影响 |
| 3.9 细胞内活化caspase-3 水平的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
| 个人简历 |
（8）新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗结肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写词简表 |
| 前言 |
| 第一章 磷酸钙纳米颗粒的制备及应用研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1. 仪器及试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 分析与讨论 |
| 第二章 靶向自杀基因载体的构建 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 技术路线 |
| 第二节 实验结果 |
| 1. 自杀基因 yCD 的克隆 |
| 2. 启动子 CEA 及 CMV 增强子的克隆 |
| 3. CV 融合启动子的克隆 |
| 4. 自杀基因 TK 的克隆及其自杀基因载体 pcDNA(3.1)CVyCDglyTK 的构建 |
| 5. 自杀基因与启动子序列的分析 |
| 第三节 分析与讨论 |
| 第三章 建立稳定表达自杀基因的结肠癌细胞株 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 yCDglyTK 融合自杀基因前药系统对结肠癌细胞杀伤作用 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 分析与讨论 |
| 第五章 yCDglyTK 融合自杀基因前药系统裸鼠动物模型实验 |
| 第一节 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 试验结果 |
| 第二节 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 在读博士期间获奖情况 |
（9）KDR启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸治疗乳腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动双自杀基因对MCF-7及ECV304细胞的靶向杀伤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Survivin反义寡核苷酸对MCF-7及ECV304细胞的增殖抑制作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 KDR启动子驱动双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对MCF-7及ECV304细胞的体外特异性杀伤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 KDR启动子驱动双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对乳腺癌裸鼠的体内抑瘤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述(1) |
| 综述(2) |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸治疗大肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 前言 |
| 第二部分 Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 中英文对照缩略词 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
四、逆转录病毒介导HSVtk基因转导体外抗结肠癌的作用（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]复方苦参注液射增效顺铂抗p53突变型结肠癌作用及机制研究[D]. 鲁玉凡. 山西大学, 2021(12)
- [3]STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究[D]. 杜华珊. 吉林大学, 2021(01)
- [4]锌指蛋白70在结肠炎相关结直肠癌发生发展及铃兰毒苷抗结直肠癌作用机制研究[D]. 张志宏. 延边大学, 2021(02)
- [5]低浓度地西他滨促HT29结肠癌细胞增殖和机制研究[D]. 王枭杰. 福建医科大学, 2021(02)
- [6]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [7]Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用[D]. 李勇芳. 山西医科大学, 2016(08)
- [8]新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗结肠癌的实验研究[D]. 刘霆. 中南大学, 2007(01)
- [9]KDR启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸治疗乳腺癌的实验研究[D]. 姚航. 第一军医大学, 2007(09)
- [10]VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸治疗大肠癌的实验研究[D]. 李瑞. 第一军医大学, 2007(02)